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1、学院(部)材料与化学化工学部题 目培美曲塞囊泡纳米药物的制备目 录中文摘要1Abstract2第一章 前言3第二章 实验部分52.1 材料与试剂52.2 PEG-P(TMC-DTC)聚合物囊泡的制备62.3 培美曲塞纳米囊泡药物制备条件筛选62.3.1 不同Hepes缓冲溶液的筛选62.3.2 不同的缓冲液pH值的筛选72.3.3 不同的制备温度与转速的筛选72.3.4 不同聚合物溶剂和螯合剂的筛选72.3.5 不同的钙离子浓度的筛选以及理论载药量的筛选72.3.6 透析与过柱方法的筛选8第三章 结果与讨论93.1 培美曲塞纳米囊泡药物制备条件筛选93.1.1 不同Hepes缓冲溶液的影响93
2、.1.2 不同的缓冲液pH值的影响93.1.3 不同的制备温度与转速的影响103.1.4 不同聚合物溶剂和螯合剂的影响103.1.5 不同的钙离子浓度的筛选以及理论载药量的影响113.1.6 透析与过柱的影响11参考文献15致谢16培美曲塞囊泡纳米药物的制备中文摘要培美曲塞（PEM）是一种叶酸拮抗剂，是多靶点抗肿瘤药物，在许多实体瘤包括恶性胸膜间皮瘤中具有良好的临床抗肿瘤活性。然而，PEM在单独使用时体内抗肿瘤活性低，这可能是其细胞穿透能力差、生物利用度低，或是剂量限制性副作用。为了克服这些问题并获得有效的抗肿瘤活性，本论文研究了聚合物囊泡作为纳米药物载体来制备PEM囊泡纳米药物。聚合物囊泡作
3、为纳米药物载体面临着许多挑战，如囊泡粒径不合适、囊泡载药量不理想或制备繁琐等。本论文主要对PEM囊泡纳米药物的主动装载药物进行了探索，优化了不同制备条件。利用动态光散射粒度仪和紫外-可见分光光度计分别测定在不同条件下制备的囊泡纳米药物的粒径大小和载药量，探究不同的条件对囊泡的粒径和载药量的影响，并且优化制备条件使得囊泡纳米药物的粒径和载药量能同时较为理想。关键词：培美曲塞，囊泡，主动装载，抗肿瘤作者： 邓礼良 指导教师： 钟志远 教授AbstractPemetrexed (PEM) is a multi-targeted antifolate drug with good anti-tumor
4、 activity in many solid tumors including malignant pleural mesothelioma (MPM). However, PEM does not show sufficient anti-tumor activity in vivo when used alone, possibly due to insufficient cell penetration leading to low bioavailability or dose-limiting side-effects. To overcome these problems and
5、 obtain effective anti-tumor activity, in this thesis we prepared PEM polymersomal nanomedicines by applying polymersomes as nanocarriers to encapsulate PEM. As drug nanocarriers, polymersomes face many challenges, such as improper size, unsatisfactory drug loading content or complicated preparation
6、 procedure. This thesis mainly explored and optimized the preparation conditions of PEM polymersomal nanomedicines using active loading method. Dynamic light scattering particle size analyzer and UV-visible spectrophotometer were used respectively for the determination of polymersome size and drug l
7、oading content of the prepared polymersomal nanomedicines. The effects of different preparation conditions on the size and drug loading contents were investigated and preparation conditions for obtaining ideal polymersome size and drug loading content at the same time were screened.KEY WORDS: pemetr
8、exed, vesicles, active loading, anti-tumorWritten by: Liliang Deng Supervised by: Prof. Zhiyuan Zhong第一章 前言 聚合物囊泡自从上个世纪后期开始，很多人投入了相关的研究工作，尤其是近年来，人们发现囊泡可以作为有效的纳米药物载体，这也吸引了越来越多的研究者的关注。囊泡是由两亲性分子，在水相中自组装形成的具有双层膜结构的分子有序结合体。双亲性共聚物在水溶液中通过自组装而形成的聚合物囊泡具有中空结构的内腔，该内腔与外界水介质被聚合物膜隔离开。聚合物囊泡的结构与脂质体囊泡的结构相似，同时与脂质体囊泡相
9、比也具有强大的优势，例如分子量比较高，所以可以形成更加厚而稳定的聚合物膜、可在很大范围内设计或选择聚合物带来的性质可调的聚合物膜，而且聚合物囊泡在装载亲水性或疏水性药物中能发挥重要作用。 近年来，世界各地的癌症发病率和死亡率均逐年上升，这不仅严重威胁人类的健康，同时也对社会和经济的发展造成了沉重的负担。目前临床上治疗癌症的主要方法还是手术切除、放射治疗、化学治疗。其中化疗药物虽能直接抑制肿瘤生长、运用广泛，但是由于抗癌药物并不具有选择性，因此无法识别癌细胞和正常细胞，对人体有很强的系统毒性。例如疏水性抗癌药物（如紫杉醇、阿霉素和5-氟尿嘧啶等）由于水溶性差，通常生物利用度比较低；而亲水性抗癌药
10、物（如盐酸多柔比星、盐酸柔红霉素、盐酸米托蒽醌、硫酸长春新碱和生物药物等）的体内循环时间短、肿瘤穿透性差。因此目前急需找到安全有效的载药的方法。目前已经开始探索的纳米药物载体诸如脂质体、聚合物胶束等粒径在 20-200 纳米，能有效提高疏水药物的溶解性、提高药物在肿瘤处的富集量、改变药物的体内分布，进而提高药物的生物利用率、减小毒副作用。到目前为止，已有 12 种纳米药物被批准临床使用，1000多种已进入不同阶段的临床试验中1。如前所述，聚合物囊泡同时具有脂质体和聚合物胶束的优点，不仅可以装载疏水药物，还能装载并且保护亲水药物，效果比脂质体更好，为亲水性抗癌药物的装载、靶向治疗肿瘤带来了福音。
11、在全世界范围内，世界各国的研究者们已经在聚合物囊泡纳米药物方面开展了很多前沿性的工作，针对纳米药物应用的各个重要步骤，开发了各种类型的囊泡，其中包括刺激响应性囊泡、循环稳定的囊泡、肿瘤主动靶向囊泡、具有不对称膜型囊泡、生物可降解囊泡等众多功能性囊泡，为囊泡纳米药物的临床推进奠定了坚实的基础。药物载体是一种能改变药物进入人体内的方式和在人体内的分布，同时可以控制药物释放的体系。该体系可防止药物短时间降解、失活、排泄以及发生人体免疫反应2。为了寻找合适的药物载体，研究者们对蛋白质、脂质体以及单克隆抗体等各种体系进行了大量研究。其中表面活性剂缔合形成的多种分子有序组合体如胶束、微乳液、液晶及囊泡等，
12、具有包载药物分子的能力以及与生物膜的良好相容性和渗透性，成为药物载体的重要研究领域3-4。囊泡是由两亲性分子，如天然的、合成的表面活性剂及不能简单缔合成胶团的磷脂，分散于水中自发形成的一类具有封闭双层结构的分子有序结合体5。与从低分子量脂质体自组装而成的脂质囊泡不同，聚合物囊泡是由具有双亲结构的嵌段共聚物、接枝共聚物或树枝状聚合物自组装形成的一类高分子聚集体。聚合物囊泡具有稳定性高、通透性可设计以及可进一步功能化修饰等优点，可作为一种疾病诊断、药物输送、微反应器等的新型多功能工具6-9。此外，聚合物囊泡所具有疏水性的膜及巨大的亲水性的内腔，使其具有同时运载亲、疏水性药物的能力。聚合物囊泡的双层
13、膜结构与细胞膜之间有良好的相容性，因此可以成为理想的体内药物输送载体。培美曲塞（Pemetrexed，商品名Alimta）是一种含有吡咯嘧啶基团的叶酸拮抗制剂，它可以破坏细胞内叶酸参与的代谢过程，从而达到抑制细胞复制，抑制肿瘤的生长的效果。体外研究表明，培美曲塞能够抑制胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶和甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶的活性，这三种都是合成叶酸所必需的酶。培美曲塞是礼来公司推出的抗癌新药，已获美国食品和药品管理局（FDA)的批准在临床上与顺铂联合用于恶性胸膜间皮瘤的一线治疗，但是在直接使用时，生物利用率很低，因此需要我们找到合适的药物载体以提高其生物利用率。本实验中，我们通过两嵌段聚合物聚
14、乙二醇-b-聚（三亚甲基碳酸酯-co-1,2-二硫戊环三亚甲基碳酸酯）（PEG-P(TMC-DTC)）自组装制备的还原敏感聚合物囊泡，用于装载多靶点抗叶酸药物PEM。探索在不同的制备条件对聚合物囊泡本身的影响，以及对囊泡载药情况的影响。第二章 实验部分2.1 原料与试剂表1药品及规格药品名称规格公司聚乙二醇单甲醚(PEG-OH)Mn=5.0 kg/molFluka双硫戊环三亚甲基碳酸酯（DTC）纯度99%根据实验室报道的文献合成N, N-二甲基甲酰胺（DMF）纯度99%国药集团二甲基亚砜（DMSO）纯度99%国药集团十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）纯度99%国药集团二水合磷酸二氢
15、钠（NaH2PO42H2O）纯度99%国药集团醋酸钙Ca(CH3COO)2纯度99%国药集团N-(2-羟乙基)哌嗪-N-2-乙烷磺酸（Hepes）纯度99%国药集团仪器：核磁共振氢谱（1H NMR）由 400 MHz 超导核磁共振谱仪（Unity Inova，美国瓦里安）测定，氘代氯仿（CDCl3）为溶剂，化学位移以溶剂峰为参考标准。聚合物分子量以及分子量分布由凝胶渗透色谱仪（GPC）测定，使用 Waters 1515 高效液相色谱仪，RI 2410 示差折射率指数检测器和 PL-Gel （500 and Mixed C）凝胶柱并辅以保护柱，以 DMF 为流动相，流动速率为 0.8 mL/min，温度为 40 C，采用一系列单分散线性聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）作为标样来校正柱子。胶束粒径和粒径分布通过 Zeta sizer Nano-ZS 动态光散射仪（英国 Malvern公司）测定，温度为 25 C，采用 He/Ne 激光光源和背折射检测器，波长为 633 nm。2.2 PE
