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1、南昌大学实验报告淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定一、实验目的：1、学习从土壤中分离微生物的方法；2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法I.I i . I 3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。二、实验原理：土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型 的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的 微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到 的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶 的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命 活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产 生菌。在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色， 出现透明圈，可以通过透明
2、圈的大小来初步判断菌种产淀粉 的能力。淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括a淀粉酶和B -淀粉酶等，a -淀粉酶可从淀 粉分子内部切断淀粉的a -1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有 6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm 处有较大的吸收峰，可用分光光度计测 定。随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的 糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时 间内蓝色消失的程度为指标来测定a-淀粉酶的活力。三、实验器材及试剂：1、培养基：(1 )分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基(
3、牛肉膏Z龙；7飞* I,13g、蛋白胨10g、NaCI5g、溶于1000mL 蒸馏水中，再加 入15g琼脂粉，pH调至7.2 , 121 C灭菌15min，待冷却 至50 C左右时，于超净工作台倒平板)(2) 筛选培养基：淀粉培养基(可溶性淀粉 20g，硝酸 钾1g,磷酸氢二钾0.5g,氯化钠0.5g,硫酸镁0.5g,硫酸亚铁 0.01g,琼脂20g,水1000毫升，调整pH值到7.27.4。)(3) 摇瓶培养：淀粉培养液。2、试剂：碘液、2%可溶性淀粉、pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、0.5mol/L 乙酸、0.85%生理盐水。3、器材：培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作
4、台、恒温水浴锅、分光光度计。四、实验步骤：1、淀粉产生菌的筛选：（1 ）采集土样，并用无菌水稀释成菌悬液；（2）配置牛肉膏蛋白胨固体培养基及淀粉培养基，倒 平板备用；（3 ）将制好的菌悬液与超净工作台上涂到牛肉膏蛋白胨平板上，于37摄氏度培养箱中培养一天；（4 ）挑取整个菌落，将其移入淀粉培养基中，继续放在37摄氏度培养箱中培养两天；y龙；I vJ- A y（5）将碘液滴在平板上，观察透明圈的大小。2、酶活力测定：（1 ）选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培养，将菌溶 于5ml无菌生理盐水中，吸取此培养液加入淀粉培养液中， 30摄氏度摇瓶培养72h。（2）酶液稀释：取发酵液进行 4000r/min
5、 离心5min，取上清液，用 缓冲液适当稀释。（3 ）标准曲线制作：准备七支试管，按照下表配置混合液。使用分光光度计 策规定各管溶液在 660nm 下的0D值。然后以淀粉浓度为 横坐标，吸光度为纵坐标，做标准曲线。（4）酶活力测定取稀释的粗酶液也按照下表中七号管 的要求配置混合液，测得吸光度后，在标准曲线上查出相应的淀粉浓度，求出被酶消耗的淀粉量管号i234567淀粉稀释液/ml2（ 0%）2( 0.2%)2( 0.5%)2( 1.0%)2( 1.5%)2( 2.0%)2(2.0%)缓冲液/ml111111140摄氏度水浴保温5min管号12345.；67蒸馏水/ml1111110粗酶液/ml
6、000000140摄氏度水浴保温30min，然后放入沸水浴5min,每管加入稀碘液1ml（5）酶活力测定：酶活力以每毫升粗酶液在 40摄氏度，pH6.0的条件下 每小时所分解的淀粉毫克数来衡量。五、实验结果：1淀粉产生菌的筛选：淀粉产生菌透明圈的检验图2、酶活力测定：（1）实验预测数据：管号1234567分解淀粉数/mg00.2350.5841.1071.3751.7881.540(2)计算：样品的 OD660=1.540查标准曲线可得： 淀粉含量=1.540/0.047=32.766mg 初始淀粉含量=2g/100ml x 2ml=0.04g=40mg被消耗的淀粉含量=40mg - 32.766mg=7.234mg酶活力=7.234mg/(1ml x 0.5h)=14.468mg/(ml h)六、实验结果分析：平板菌落水解圈直径大小受许多因素的影响，例如菌种特性、接种量大小、培养时间、酶的稳定性、温度范围、平 I !.l I,1 板厚度等。绘制的淀粉含量标准曲线也会受实验室环境影响 及误差而造成不准确，酶活力的表示方法也有多种，仅是一 个相对的数值。
