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1、分子生物学实验报告学院：生命科学学院 专业年级：生技093 姓名：殷晓杰 学好：2009013452大肠杆菌转基因体系的建立和植物基因组的提取摘要：分子生物学是在分子水平研究生命现象的一门学科，主要研究 生物大分子的结构、功能和生物合成从而阐明生命现象本质。分子生 物学在短短的几十年间经历了一个飞速的发展过程，从探究遗传物质 的本质到阐明DNA的双螺旋结构，从蛋白质的序列分析到DNA高 通量测序，从生物大分子的基本结构到现在的基因组学、蛋白质组学 等等，可以看到分子生物学的伟大前进。于此相伴的是分子生物实验 技术的飞速革新和发展。分子生物学成了生命科学研究的基础手段和 先进前沿，转基因就是热点
2、之一。本文先是对转基因技术作了一个简 单的综述，然后主要是描述了实验室大肠杆菌转基因体系的建立和检 测方法。实验材料是含p38质粒的大肠杆菌（实验室命名）和TOP10 大肠杆菌（用于制备感受态细胞），最后的检测方法是用的经典的 southern blotingo另外，本文最后还简述了植物基因组的提取方法。关键词大肠杆菌转基因体系植物基因组提取前言分子生物学是在分子水平研究生命现象的一门学科，主要研究 生物大分子的结构、功能和生物合成从而阐明生命现象本质。分子生 物学在短短的几十年间经历了一个飞速的发展过程，从探究遗传物质 的本质到阐明DNA的双螺旋结构，从蛋白质的序列分析到DNA高 通量测序，
3、从生物大分子的基本结构到现在的基因组学、蛋白质组学 等等，可以看到分子生物学的伟大前进。于此相伴的是分子生物实验 技术的飞速革新和发展。分子生物学已然成了生命科学研究的基础手 段和先进前沿，转基因就是热点之一。所谓的转基因技术，是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因 组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰的一 种实验技术。转基因技术一般可分为目的基因的获得、粘性末端切割 和载体的构建及转导这几个过程。按照目的基因受体的不通过可以把 转基因技术分为植物转基因技术和动物转基因技术，还有细菌转基因 技术。对于植物转基因技术转化方法目前已经得到了很好的发展，基 本上可以分成三类：
4、载体介导的基因转化（如农杆菌介导法和病毒介 导法）、DNA直接导入法（如基因枪法、PEG法、脂质体法、电激法、 显微注射法、激光微束法、超声波法等）和种质系统介导的基因转化（如花粉管通道法、浸泡法和子房、胚囊注射法等）。转基因动物 的制作方法有显微注射法、逆转录病毒感染胚胎法、精子载体法、卵 母细胞精子注射法、ES细胞介导的基因转移法及人工酵母染色体法 等。对于微生物转基因技术目的基因的转导，可以通过制备感受态 细胞改变细胞的通透性来实现。目前，转基因技术是一个非常热门的研究技术，应用的也是十分普遍， 同基因工程、细胞工程紧密联系在一起。转基因的应用和研究热点， 有以下几个方面：1. 遗传育种
5、传统育种只能在同种或亲缘关系很近的物种之间进 行，且自发性突变作为选种的前提，其发生机率相当低。转基 因技术则可克服上述问题。通过生物信息学以及分子生物学的 方法，预测并获得一定优越性的基因，通过转基因技术获得具 有该优良性状新的物种或者改良物种，是转基因技术一个热门 的研究方向。现在已经的到了蓬勃的发展，并且还将继续火热 下去。2. 研究模型的建立 利用转基因技术，可以很好的建立生命科学 研究的实验室研究的生物模型。例如，现代医学研究证明人类 的大多数疾病都与遗传有关，适当的动物模型对研究基因突变 而引起遗传疾病的发病机制是十分有效的。而用转基因动物的 方法生产人类遗传疾病模型则成为人类遗传
6、疾病研究的一个极 为有效的途径。3. 生物反应器的研究利用转基因受体生产转入基因的产物是转 基因技术的另一个重要应用。在动物上，乳腺反应器就是一个 较为成功的例子。发酵工程用的菌很多的也是转基因菌，获得 的产物有些则是转入目的基因所表达的3。4. 转基因安全性研究 近年来转基因生物安全性问题已引起了公 众的普遍担忧，严重制约了转基因技术成果的推广应用。很多 研究者从转基因安全性的角度，对转基因技术进行了深入的探 究，开发出了许多安全转基因技术。比如：无选择性标记基因 技术、安全标记基因技术、叶绿体转化技术、终止子技术、雄 性不育技术、外源基因删除技术。其中外源基因删除技术表现 出很大的应用前景
7、4。综上是转基因技术的一个简单的介绍。可以看出转基因技术的科研价 值的重要性和应用的普遍性。本次实验旨在建立一个实验室内的大肠杆菌的转基因实验体系，同时涉及到了植物转基因技术的准备实验一 植物基因组的提取及体外扩增。实验材料、试剂、仪器1. 实验材料1.1.1细菌培养：（1）LB培养基（提前配好），酵母提取液，氯化钠，琼脂粉，氢氧 化钠（1M/L），抗生素（氨苄青霉素）1.1.2质粒DNA提取：LB液体培养基，LB平板培养基，溶液I ： 50mmol / L葡萄糖，10mmol /LEDTA,25mmolTris-Cl（PH8.0），溶液n : 0.2mmol / LNaoH, 1 %SDS,
8、 溶液3： ph4.8的醋酸钾溶液（5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml, 水 28.5ml） ,TE 缓冲液（ph8.0） :10mmol / LTris-HCl,1mmol / LEDTA, 无水乙醇，70%乙醇。1.1.3琼脂糖凝胶电泳：DNA样品，TEB缓冲液（5X用时需稀释10倍）点样缓冲液Loading Buffer（10X）:0.25%漠酚蓝，40%廿油，漠乙啶染色液（EB）： 10mg /ml漠乙啶（致癌小心），琼脂糖 1.1.4质粒DNA酶切及电泳分析：EcoRI酶，入DNA,TEB缓冲液（5X，用时稀释10倍），点样缓冲液 loading Buffer （同上），
9、漠乙啶染色液（EB），琼脂糖。1.1.5聚合酶链式反应（PCR ）技术体外扩增DNA：TapDNA聚合酶，10 X反应缓冲液（含25mmolMgCl2） ,Dntp,引物（P1，P2）漠乙啶染色液，点样缓冲液1.1. 6质粒载体和外源DNA的连接反应：目标DNA片段（RT-PCR扩增产物），载体（Pgemt-easy载体2 X ligation 缓冲液，T4DNA 连接酶，ddH2O1.1.7感受态细胞的制备及转化：0.1mol /LCaCl2取20ulPCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析，LB液 体培养基（见前面），氨苄青霉素（100mg/ml）1.1. 8 DNA 分析Southern 杂
10、交：Standard buffer ,Standard buffer + 50 % formamide,High SDS buffer ,Wash Solution! :2 XSSC,0.1%SDS,Wash Solution! :0.5 XSSC,0.1%SDS1.2. 1植物基因组DNA提取，酶切及电泳分析：DNA extraction:500ml （31.885g sorbitol,6.05g Tris ph8.2），Nuclei Lysis buffer:500ml（1M Tris ph7.5 100ml, 0.25M EDTA 100ml , 5M NaCl 200ml , CTAB
11、 10g , ddH2O 100ml）,5%sarkosyl（N- 月桂酰肌氨基钠盐）500ml.使用时将上述的三种溶液按1:1:0.4比例 混匀，加入亚硫酸氢钠（3.8g/l） ,65C预热，即为抽提液 1.2.2 RNA提取及纯化：DEPC，DEPC 处理的 ddH2O,RNA提取液（每 100ml 中含有）:Tris 6.06g, LiCl 6.03g EDTA 10ml SDS 50g ; 8MLiCl:33.92g LiCl 溶于 100mlDEPC，水饱和酚，氯仿，0.5M NaCl,漠乙啶，点样缓冲液1.2.3 RT-PCR扩增目的基因才cDNA:RNA模板，cDNA引物，反转录
12、缓冲液，Dntp ,AMV反转录酶，RNA抑 制剂（RNasin），Taq 酶，10XPCR 缓冲液，引物（p1,p2）2. 实验仪器（1）培养皿，（2）带帽试管，（3）涂布器，（4）高温灭菌锅，（5） 无菌操作台，（5）恒温摇床（SKY211C,made in China）， （6 ）10,100,1000ul 移液枪,（7）台式高速离心机（eppendorf,5417R,made in Geramany）， （8）摇床（同上），（9）电泳仪DYY7C型，北京六一仪器厂），（10）微波炉（LG品牌），（11 ）恒温水浴箱（DK4208 型，上海精宏实），（12 ） PCR 扩增仪（GeneA
13、mp 9700,made in Singapore），（13）凝胶成像系统，（14） 1.5ml离心管，（15）离心 管架，（16 ）杂交炉3. 实验材料含P38质粒的大肠杆菌 大肠杆菌TOP10黄化干旱胁迫处理的小麦 幼苗实验流程1. 整体实验流程结构图（1）大肠杆菌转基因体系的建立整体实验方案流程见下图1，具体实验操作后面将叙述。（2）植物基因组的提取和体外扩增 基本而言，植物是我们转基因技术应用的热点，所以设计了下面的植 物基因组的提取和体外扩增实验。细菌培养质粒提取和PCR扩增质粒酶切和PCR扩增质粒载体连接电泳检测实验结果DNA分析southern bloting感受态细胞制备和转化
14、克隆及蓝白斑筛选图1.大肠杆菌转基因实验体系流程图图2.植物DNA提取和RNA提取及cDNA扩增植物RNA的提取1植物基因组DNA提取大：图1中的直线表示理论上对于目的基因的检测应该是对转入目的 基因后的大肠杆菌而言的。2. 具体操作方法1.1细菌培养母菌活化3 7度过夜培养，然后挑取单克隆扩大培养（37度,220转每分钟，8 9小时）1.2质粒提取和PCR质粒的提取采用的是碱裂解法，参看分子克隆实验指南PCR体系如下:PCR程序如下:体系：50pL94 C 3min10 X buffer5pL94 C 45s10XdNTP5pL35cyclesk55C 45 sPrimer P11pL72
15、C 60sPrimer P21pL72 C 10min模板2pL酶1pLddH2O35pL电泳检测：点样8ul样+2ul louding buffer,电压：120V恒泳。用的是1%琼脂糖胶。1.3质粒酶切和电泳检测实验酶切体系：20ul体系Plasmid10pLEcoRI1pL10 X buffer2pLddH2O7pL过夜反应。电泳检测：如上。14质粒载体连接P38质粒的PCR产物和商业化载体（Pgemt-easy载体）连接。20ul连接体系：Buffer (10X)1ulPCR片段产物5ulReacptor1ulT4-ligase11ulddHp2ul过夜培养。1- 5感受态细胞的制备及转化1.6克隆和蓝白斑删选感受态细胞的制备，实用氯化钙对细胞壁进行处理改变其通透性。经典实验参看分子克隆实验指南转化：迅速冰浴1. 7southern 杂交依据质粒PCR产物合成的地高辛探针，杂交对象是质粒酶切产物。具体操作参看分子克隆实验指南。2. 1植物DNA的提取、PCR及电泳检测植物DNA提取采用液氮研磨CTAB抽提法，具体操作参看分子
