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1、生命的辩证认识生命的本质-协调有序的变化和运动生命的表现形式：形态、本能、习性、生命周期、社群生命的变化：静态是相对的变化和运动是永恒的，环境压力下突变，环境选择下适应环境生存。生命依赖于环境：生命存在环境，习性是在适应环境过程中形成，思想和意识是生命生存过程中对环境的反应和对生存经验的总结。生命的和谐有序性：生命变化的时空性发育与分化的实质，生命反应的协调性-生命高效运转的保证。效率的本质是协调。、辩证唯物论方法 树立唯物主义的观点，就是要承认生命是有物质基础的，生命是物质运动的一种形式。生命现象有它的客观规律，这些规律可以被人们所认识。按照辩证的观点，生物体的运动、变化是绝对的，静止、平衡
2、是相对的，因是“变”的根据，外因是“变”的条件，外因通过因起作用。对生命过程的研究，主要就是研究因与外因相互作用的规律。 *进化上真核生物比原核生物更高级第二讲动物细胞体外培养技术细胞培养：通过离体培养使活细胞发育、发化、分裂并维持其代和遗传性状。体外培养：实验要求-细胞培养室、细胞培养缓冲室、细胞贮存室和洗涤室 实验设备要求：二氧化碳培养箱（细胞培养）滤器（培养基除菌） 培养用液：1缓冲液（维持PH7.2-7.4，不干扰反应，不影响，碳酸氢钠缓冲液，HEPPES有调节PH，不属于缓冲液.平衡盐溶液加入酚红用作酸碱度变化指示剂如PBS，平衡盐溶液具有缓冲液、维持细胞渗透压功能、供给细胞生存所需
3、要能量物质、无机离子）2天然培养基 模拟细胞生长的生理环境 血清 、胎盘、水解乳蛋白3合成培养基常用的培养基有：RPMI-1640、DMEM、Hams F12（无血清）消化液：0.25%胰蛋白酶液 血清终止酶作用，0.02% EDTA溶液 具有一定的非酶性解离100 U/ml青霉素能抑制细菌细胞壁的合成, 100 g/ml链霉素能抑制细菌蛋白质的合成 原代培养 来源 怎么培养，鉴别生命活力 不同浓度不同时间培养细胞传代的操作（1）贴壁培养细胞的传代步骤 废液处理：吸去或倾出旧培养液。除残留血清：用BSS液漂洗细胞。细胞解离：用胰蛋白酶液消化至看见瓶底出现雾状、震荡法解离细胞。消化终止：吸去消化
4、液，加入含血清的培养基或加入蛋白酶抑制剂。用吸管吸取培养液吹打细胞，吸管头不要离开液面。 1000 rpm离心5 min去含胰蛋白酶的培养液。用培养液重新悬浮细胞并计数、调整细胞密度。将细胞接种到新的培养瓶。（2）悬浮培养细胞的传代步骤 1000 rpm离心5 min去旧培养液。用培养液重新悬浮细胞并计数、调整细胞密度。接种细胞影响细胞体外生长的因素：营养成分（含调节生长和功能激素、血清），温度，气相环境，PH，物理作用（高能量辐射可导致死亡，橡胶的毒性，培养液渗透压）体外培养细胞的检测 一细胞培养的常规检查-细胞形态、细胞生长、营养液、微生物污染二体外培养细胞的生物学检测 1 形态学方面 一
5、般形态观察，超微结构观察，细胞骨架观察2细胞生长方面 生长曲线，细胞分裂指数 接种存活率（贴壁存活细胞数/接种细胞数）X100% 克隆形成率（形成克隆数/接种细胞数）X100%克隆形成率大的细胞群，独立生存能力强。3活细胞直接观察 4 细胞遗传学方面-核型分析，软琼脂培养，ConA凝聚试验，组织浸润试验，异种动物接种 三 体外培养的肿瘤细胞生物学特性 1肿瘤细胞的生物学特性-细胞形态：细胞骨架系统在肿瘤细胞常杂乱排列.异质性，恶性，不死性（致瘤性和不死性很可能是两个不同的独立性状，受不同基因支配。 研究证明，myc基因与不死性有关，但无致瘤性，只有当myc加上另外一个ras基因共同作用时，才产
6、生致瘤性） 凡混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染.支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间，支原体热耐受性差特点 污染排除：抗生素5-10倍量干细胞SC指每个具有生命的有机体在从其最初形式发展成为完整体的过程中，始终保留着部分未分化的原始细胞。*若把十几个ES细胞在体外注射至另一胚泡，使之与受体胚胎细胞混合，再移植入假孕受体子宫，可发育获得嵌合体。ES细胞可参与受体胚胎的各种器官组织并形成生殖细胞，后者称为种系传递胚胎干细胞的共性特征: 1、与普通细胞相比，胚胎干细胞的体积较小，细胞核大，核质比高，核仁明显，体外培养时呈扁平而紧密的多细胞克隆状生长。 2、在正常培
7、养体系中，ES细胞能保持非常稳定的核型。在ES细胞的周期中，S期较长，占据整个周期中的大部分时间，无G1期节点(checkpoint)。 3、核型为XX的ES细胞不出现X染色体失活现象。*ES细胞的基本特性：1 多能性体外诱导分化3个胚层，分化产生组成多种畸胎瘤，抑制分化培养，可保持未分化状态，并能增殖传代2种系传递功能 3异体动物接种细胞分化潜能特征： 形态 大小，形状 表面蛋白有何不同 核质比 细胞器（亚细胞结构） 细胞核分化抑制物的选择设计 a饲养层（成系的小鼠胎儿成纤维细胞STO，原代PMEF）b条件培养基（如Buffalo大鼠肝细胞BRL,具有消除饲养层细胞干扰、免受致癌剂丝裂霉素C
8、影响） C外源性分化抑制因子 ES细胞的分化抑制是多种因子共同作用的结果，其中起主导作用的是白血病抑制因子（LIF/DIA）。培养基的添加物选择：2-巯基乙醇(贴壁能力和活力 )、非必需氨基酸。早期胚胎选择：1碱性磷酸酶染色法或荧光抗体标记法 全能性ES表面含丰富的AKP（碱性磷酸酶）及SSEA-1（表达在表面的胚胎阶段特异性抗原）2最佳胚胎发育阶段*ES细胞的冷冻保存：二甲基亚砜DMEM保护作用 ES 与EG的区别造血干细胞的基本特性：1具有高度自我更新能力75%的造血干细胞处于不发生分裂的G0（只代）期，不进行DNA合成和有丝分裂。正常情况下，造血干细胞在不断产生造血祖细胞的同时，又能使其
9、数量保持不变，既不增加也不减少，而且还能保持自身特性不变。正常干细胞只进行不对称性有丝分裂，还有在体能够长期重建造血2具有很强的分化能力特征：细胞表面蛋白差异 高度表达CD34和CDw90抗原,缺乏CD33、CD71等系相关抗原造血干细胞造血祖细胞成熟细胞 鉴别：根据细胞表面的蛋白辨别造血干细胞的分化阶段，分化潜能与分裂能力成正比。 CD34抗原是造血干细胞分离纯化的主要标志NK细胞（自然杀伤细胞）是机体重要的免疫细胞，其杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体 。NK细胞的免疫疗法肿瘤、遗传病、白血病、RNA病毒、先天性糖尿病。CD4+亚群（Th细胞）分为Th1和Th2两个亚群.TH1多的-抗原抗体
10、发展.TH2多的-过敏反应 IPSCs(诱导多功能干细胞)通过基因转染技术将某些转录因子导入动物或人的体细胞, 使体细胞直接重构成为胚胎干细胞样的多潜能细胞，具有与胚胎干细胞相似的自我更新能力和发育多潜能性,同时避免了免疫排斥和伦理问题.miRNA是一类长度约为20-24个核苷酸长度的具有调控功能的非编码RNA重编程：不改变基因序列的情况下，通过表观遗传修饰如DNA甲基化来改变细胞命运的过程转基因技术概论细胞拆合：以一定的实验技术从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装还成为具有生物活性的细胞或细胞器染色体转移又称为染色体转导：把同
11、特定基因表达有关的染色体或染色体片段转入受体细胞使该基因得以表达，并能在细胞分裂中一代又一代地传递下去。有微细胞和染色体介导雌核发育（gynogenesis）：俗称假受精，意指精子虽能正常地钻入和激活卵球，但精子的细胞核并未参与卵球的发育。赫特威氏效应：只有在适当的高辐射剂量下，才能导致精子染色体完全失活，届时精子确能穿入卵，但只能起到激活卵球启动发育的作用通过胚胎制备转基因动物的方法主要方法有基因显微注射法，胚胎干细胞移植法，反转录病毒感染法和精子载体导入法等转基因鼠的获得：从幼鼠尾巴提取DNA，用PCR、Dot blot（斑点杂交）和Southern blot等多种方法在染色体及基因水平上
12、进行检测，也可以通过Northern blot和Westem blot在转录及蛋白质水平上进行检测3种转基因方法及其受精卵不同的发育阶段的关系杂交瘤细胞和单克隆抗体技术： 1976年Kohler和Milstein创建了一个方法分泌一种特异性抗体的B细胞和体外持续生长的浆细胞瘤融合，产生的杂交细胞克隆表达了抗体生成的正常B细胞和浆细胞瘤细胞的免疫球蛋白基因，同时也具有在体外无限增殖的能力免疫系统非适应性免疫由非特异性反应的细胞介导的。 适应性免疫：针对特定分子，且可经反复暴露于外源分子使之加强淋巴细胞合成细胞表面受体或分泌特异性蛋白结合外源分子。这些分泌的蛋白称为抗体，可与抗体结合的分子被称为抗
13、原，当一个分子被用于诱导适应性反应时，这个分子被叫做免疫原B细胞：分泌抗体，并在细胞表面携带同一抗体的修饰型，功能相当于受体。细胞毒性T细胞：携带结合抗原的细胞表面受体。辅助T细胞：在控制B细胞和细胞毒性T细胞反应方面起关键的调节作用。含有抗原结合位点的两个区域被称作Fab片段，涉及到免疫调节的蛋白区称作Fc片段，在Fab和Fc片段之间的部分称作铰链区。免疫原性抗免性半抗性佐剂*原生质体融合技术细菌细胞壁的溶解渗透稳定剂促融合剂融合所需条件融合子的检出酵母原生质作融合的技术要点动物体外受精技术卵母细胞的来源：有腔卵泡的卵母细胞-屠宰场的废弃卵巢；活体卵巢 腔前卵泡的卵母细胞离体分离卵母细胞体外
14、成熟（指长足的卵母细胞（存在于有腔卵泡中）向成熟卵子转化的过程，该过程发生在排卵前FSH和LH分泌高峰之后）的特征及标志：生发泡破裂 染色体凝集纺锤体形成 极体排出 透明带软化 卵丘细胞扩展 精子获能需要条件 有能力到达卵母细胞，并穿过透明带有能力进行顶体反应；适时暴露成熟过程中获得的蛋白结合位点，结合卵母细胞透带；可以与卵母细胞融合并进入到卵质中。体外受精（IVF） 一精子预处理 浮游程序：将洗涤后的精液加入到TALP溶液中，在培养箱中静置3060min，让精子在TALP中浮游。 玻璃棉过滤：用于提高精子的穿透能力。 BSA/Percoll密度梯度离心：形态好的精子比精子差的精子密度大。 透
15、明质酸酶处理：可提高IVF效果，并且让精子通过透明质酸酶浮游到IVF液中，可省去传统的洗涤和离心步骤。 洗涤：可以有效地去掉精浆蛋白。对于冷冻精液，洗涤还可迅速地将冷冻保护剂去掉。 精子浓度：精/卵比一般为1000020000:1；精卵共孵育的时间与受精体系有关。提高精子活力的方法 咖啡因：能抑制磷酸二酯酶，导致cAMP积累。咖啡因可增强牛冻精的穿卵能力。在小鼠IVF中，咖啡因可通过提高小鼠精子活力而提高受精率，并且还能提高顶体反应、精子结合透明带能力及精子与卵膜的融合能力。 PHE：青霉胺、亚牛磺酸和肾上腺素的混合物。 2-氯腺苷和2-脱氧腺苷腺苷：可刺激cAMP的产量而提高精子活力。 血小板激活因子（PAF）：与排卵时卵泡破裂有关，因而在生殖中有重要作用。PAF对多种动物精子的活力、顶体反应和体外受精均有促进作用。 其它物质：GSH可提高精子的活力和受精率 ；己酮可可碱和茶碱是磷酸二酯酶抑制剂，适当浓度可提高精子活力顶体反应 精子获能后对Ca2+的通透性改变，诱发顶体反应。Ca2+流是顶体反应的主导因素，而钙调蛋白参与了这一过程。Ca2+流导致腺苷酸环化酶激活，生成大量cAMP，cAMP又激活蛋白激酶A，使得蛋白磷酸化作用加强。动物克隆技
