从患者开始谈基因检测地整个流程

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1、从患者开始谈基因检测的整个流程题记：几颗玉米放进爆米花机器，出来便是爆米花；一 个智力一般的高中生放到人大附中，三年后出来就是国际一 流大学新生；二两五花肉和几个青椒交给一名厨师，出来的 便是香喷喷的回锅肉。可是这中间都发生了啥？是什么重要 步骤将初始原料打磨成了成品？ 10ml 的血液或者一块肿瘤 组织，最终变成了一份 20 页的检测报告？这是怎么实现的？ 中间都发生了什么？本文旨在回答这个问题。 基因检测的整个流程可分为哪几个大的步骤？概况性地了 解一个事务的框架是很有必要的，因为这样我们心里会有 “底”。不管别人怎么分，我简单粗暴地把它分为四个程序： 1，检测前咨询部分； 2 ，实验室部

2、分； 3 ，信息分析部分； 4， 临床解读部分。五脏俱全的基因检测公司应该包含以上所有 的四个程序，除非存在部分业务外包的情况，例如有的公司 只做临床解读部分。 1 ）检测前咨询部分：不是所有的癌症 患者都应该检测，都值得检测，检测目的是为了明确是否可 以使用靶向药物， 还是仅仅为了玩， 选择哪种产品更加适合， 这些都是需要在这部分搞清楚。 2 ）实验部分：应该取多少 组织样本， 测序过程中有哪些细节步骤， 这可是个核心环节。 3）信息分析：实验部分做完以后所得到的是一大堆序列， 不分析就是一堆垃圾，信息部要做的就是从这些垃圾中挑选 黄金。 4 ）临床解读：黄金挑选出来不拿去换成大米然后进 肚

3、，那也没什么用，基因检测的结果有什么意义，对临床实 践又何指导，全在这里了。四个程序，每个程序又包含哪些 小工序呢？通过上面的介绍，我们可以大体了解基因检测分 为四个程序，也明白四个程序主要做什么。可是，每一个程 序又具体涉及哪些小程序呢？剖析程序的过程，就是知识差 异化的过程。 1 ，检测前咨询：患者预期、产品选择； 2 ，实 验部分：样本获取与运输、 DNA 制备与文库构建、质控与 上机测序； 3，信息分析部分：数据分析、报告初稿； 4 ，临 床解读部分：检测报告、临床实践、 报告解读 / 人文关怀。 总 而言之， 简单来说， 从明确患者的检测目的开始 （用药指导， 耐药后寻找新的方案，仅

4、检测一个基因或多个基因突变状态 等），到选择合适的产品，然后获取规范的样本（血液，组 织，唾液等） ，然后合适的运输方式到达实验室，然后一些 列的规范实验室操作及数据分析，最后到科学的检测报告与 咨询服务。这就是四个程序所包含的内容。每一个程序分为 许多小工序，每一个小工序又有许多学问与讲究。下面将会 详细介绍每一个小工序。程序一：检测前咨询部分 1.1 ：患 者预期。销售经理、产品经理、主治医生与患者需要充分沟 通，明确该基因检测的目的，知道检测技术的局限性，做好 患者的预期控制。 1.2 ：产品选择。对于基因检测产品来说， 产品选择几乎等同于检测基因的选择。哪些基因需要强行检 测、哪些基因

5、推荐检测、哪些基因有一定的检测价值，这些 需要阐述清楚。最后，根据患者的经济情况与病情，综合选 择（这是理想状况） 。实际操作过程中，销售经理往往会以 经济利益为导向。 1.3 ：临床信息。 患者的临床信息对于基因 检测报告者有重要意义，信息掌握越全面报告越个性化，咨 询解读也更有针对性。因此，完整详实的临床申请单需要提 供。程序二：实验部分2.1 ：样本类型。 需要明确一点， 能够运用无创的尽量用无创 （唾液与血液） ，因为没有一个患者希望无缘无故的在自己 身上打洞。固体：手术样本，穿刺样本，石蜡包埋组织，石 蜡切片组织；液体：全血，血清 血细胞，胸水，腹水，唾 液。1）手术样本：（肿瘤组织

6、50mg，癌旁正常组织25mg , 收到组织后立即用至少 5 倍体积的 10% 中性福尔马林固定 液固定），切片25张以上，厚度5 pm，肿瘤细胞占比50% , 坏死组织区域 2）穿刺样本：穿刺一针以上，肿瘤细胞占比 50%，坏死组织区域 3）石蜡包埋组织：常温保存运输即 可，最好是 1 年以内。 4）石蜡切片组织：常温保存运输即 可，最好是 6 周以内。 5）全血： 6ml-10ml for NGS （Streck 管，含有保存液，负压真空抽满 ），轻轻垂直平面 90旋转 10次，6-25 C （常温）运输，3 （ 7 ）日内送达，可用干冰/ 制热剂制造维持环境温度。6）血浆 血细胞 （普通

7、试管） ：抽血后 2h内将全血4 C 1600g 离心10min，分别收集上清和沉淀至离心管中；上清再4 C 16000g 离心 10min ，收集上清血浆转移至 15mL 离心管中。血浆 血细胞样品， 均封口膜封口，干冰运输。 7 ）胸水： 8）腹水：这两个情况 比较少，至少我们公司很少遇到这样的样本。 2.2 ：质控。血 液样本是否合格，是否可以进行测序上机，样本质量怎么 样？安捷伦 2100 生物分析仪或者 4200 TapeStation 核酸 分析仪， 通过 DNA 完整值 （DIN ）来数字化基因组 DNA 的 完整性。如果不用这些仪器，可以通过跑胶来实现这一步。 质控不合格，只有

8、重新采样。标准流程只需要0.1-1DNA , DNA 的 0D 260/280 在 1.8-2.0 之间,RNA 的 RIN 值8.0。 实验中发现，只要 RIN 值大于 7，就可以获得比较满意的结 果。（RIN : RNA完整值）。总的来说，质控两个指标：1）足够的 DNA 量； 2）完整的 DNA 基因组。这个步骤在构建 文库后上机测序前完成。 2.3 ：文库构建。简而言之，获取足 够量的 /目的的 /前期适合上机测序而标准处理的 DNA 。其程 序主要有：片段化，连接，扩增。 1 ）片段化：我们总不能 直接将那么长的 DNA 去测序吧，测序仪就只能一次测几百 bp 的 DNA ，超声波片

9、段化等方法，获得 DNA 片段为正态 分布 200-500bp ，通过一定方法（切割琼脂糖凝胶电泳条 带）选择所需长度的 DNA 片段（ 150-200bp ），其它的片 段就扔了（不影响覆盖范围） 。 2 ）末端修补： 上面的方法 （物 理方法）片段化的 DNA ，一般来说两端都被破坏了，不再是平平整整的了，而后续步骤需要在两端加测序接头，所以 我们得先把这个破坏的两端修补好。 修补所需三种酶： 5端 延伸的酶， 5端连接的酶， 3端延伸的酶。 3）3端加 A ： 片段化且两端修补好的 DNA ，3端加上一个碱基 A ，而下 一步骤的连接接头 3 端有一个碱基 T,这样就实现了碱基 互补而连

10、接起来了。这样做还有以下几个原因：提供连接效 率；防止接头与 DNA 片段多种方向连接；减少接头之间的 连接。值得一提的是 1）2）3）的步骤可以用 WGS Framentation Mix搞定。 4 ）两端加接头：首先明确接头 3端有一个突出的碱基 T,插入片段3端有一个突出的碱 基 A ；其次，这个工序是在插入片段两端加入东西；这个东 西包括以下几个部分：测序接头（ P5 ， P7 ；测序时用于与种 植在 Flow Cell 上的序列碱基互补配对用） ， Barcode （用于 标识该条 DNA 片段属于哪个样本， 4 个碱基），单分子编码 序列（ Index ，用于识别是哪条 DNA 片

11、段， 12 个随机碱基） ； 其中 Y 型的序列是已经商业化的试剂盒。 5）PCR 富集：如 果样本不够，那么我们就需要扩增它才能上机测序，这就是 该环节存在的必要。 由于每个经 4）处理的片段两端都有 P5 与P7，因此PCR引物只需设计与它们配对的就行了。如果 样本足够，这一步就省了呗。 6）文库定量：这里才应该是 质控，也就是 2.2 的步骤。 7）基因捕获：我们只将需要的 DNA 片段去测序，不需要的去测不是浪费钱吗？于是在测 序之前，我们就用这个工序将目的 DNA 挑选出来（为什么 要捕获）；目前目标序列捕获方法有 3 种， NimbleGesn Sequence Capture a

12、rray ， Agilent SureSelect DNA Capture Array ， Agilent SureSelect Target Enrichment System ，值得注意的是不同捕获方法可能测序仪器有不同的 要求（捕获的方法有哪些；罗氏和安捷伦） ；我们捕获的探 针设计可以自己设计，初步设计，需要检测的位点提交到商 业公司，真正的设计还是需要专业的商业公司来干（捕获探 针的由来）；例如目标区域为 100Kb ，好的探针是 100% 覆 盖这 100Kb ，而有的商业公司达不到，只能覆盖到 97% ， 那么意味着有 3% 的区域捕获不到，更谈不上对这些区域测 序了，所以覆盖率

13、很重要；对于这 100Kb 的目标片段，前 10Kb 探针捕获了 100 个片段，第 10Kb-20Kb 的探针捕获 了 10 个片段，那么这样的话就是均一性不好，最终可能会 得出结论 10Kb-20Kb 这一段突变频率过高 / 过低，因此均一 性很重要；如果一个探针设计出来想捕获目标片段，却捕获 到了别的垃圾片段，我们还对它测序，这不是浪费钱吗？所 以，探针特异性很重要。 （好的捕获是怎么样的） 。 8）PCR 扩增： PCR 再次扩增捕获的 DNA 片段，上机前再一次加足 样本量。 9 ）文库再次定量：相当于上机前的再一次质量检 测。 2.4 ：上机测序。通过前面的步骤，我们从患者身上的一

14、 块肿瘤组织或者一管血开始，然后分离提纯我们需要的基因 组 DNA ，再把这些 DNA 打成小片段，然后再在这些 DNA 小片段两头接上识别标记和测序接头，最后再通过基因捕获 技术筛选出目的 DNA ，根据需求 PCR 扩增。通过这么多步 骤，就是为上机测序做准备。一句话，上机测序的过程就是 读取这些 DNA 小片段的序列， 如 ATCTGGCTT.(160bp) ， 这样万级、亿级的 DNA 片段个数。至于这些 DNA 片段是 怎么样在机器上被测出来的，这又是个大问题，我在液体 活检有哪些这篇文章有简要说明，这里不管它，毕竟世界 上那么多事情，哪有想管就管得了的呢？至此，实验部分结 束。程序

15、三：信息分析部分3.1 ：下机数据识别。数以亿计的 DNA 小片段，一大饼，杂 乱无章，很多情况是几十个患者的样本都一起的，更乱。一 句话，这个步骤将属于不同患者的 DNA 小片段放进不同的 盒子里，分类。这是怎么实现的呢？我们在构建文库的加接 头步骤时， 同时加上了 Barcode 序列， 同一个患者使用同一 个 Barcode ，不同的患者使用不同的 Barcode ，那么计算机 通过这个 Barcode 轻松识别然后放进不同的盒子里。 值得注 意的是， DNA 是两条链，有的公司会两条链同时测序以增 加准确性，因此一个 A 患者会有两个盒子属于他( A1 ：正 义链的 DNA 小片段集合

16、； A2 ：反义链的 DNA 小片段集合) 。 还值得注意的是，如果样本是血液，有的公司会同时检测cfDNA 和 gDNA ，那么一个 B 患者就会有四个盒子属于他 （B1 ，B2 ，B3 ，B4 ）。3.2 ：图像转换。 下机的时候那些 DNA 片段最初其实是图像格式的，例如红色表示碱基 A ，绿色表 示碱基T,需要用专业工具将图像格式转换成序列。Illumina公司提供专业软件，只需对其调用就可以完成这一步骤。一 句话：图像转换成序列。 3.3 ：比对到基因图上。将这些上以 亿级的 DNA 小片段归位， 如果你是 1 号染色体的第 500 位 到第 650 位之间的片段，就把你归到这个位置下面。当然， 1 号染色体上的这个位置下面一般不止一条 DNA 片段，毕 竟有一个概念叫做测序深度，如果测序深度为 10000 ，那么 理论上该位置下面就应该有 10000 条 DNA 片段。怎么控制 是 10000 条呢？这在上机之前构建文库时，通过调节 PCR 扩增来实现。一句话：将散乱的 DN