《包涵体变性亲和层析复性方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《包涵体变性亲和层析复性方法（1页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、包涵体变性及亲和层析复性方法实验材料裂解液：20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 8.0洗涤液：20 mM Tris-HCl, 10mM EDTA, 3M 尿素，pH 8.0变性液： 20 mM Tris-HCl, 8M 尿素， 0.5M NaCl， 20mM 咪唑， pH 8.5洗脱液： 20 mM Tris-HCl, 8M 尿素， 500mM 咪唑， pH 8.5复性液： 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 M L-Arg, 0.5 mM GSH, 0.05 mM GSSG,5% 甘油， 1% PEG实验方法：1. 包涵体的变性：收集菌体
2、，加入裂解液，高压破碎， 12000rpm 离心 30min， 沉淀中加入包涵体洗涤液，充分溶解，12000rpm离心30min取沉淀，加入变 性液(1g包涵体加入15ml),碾压包涵体，置于室温充分溶解，12000rpm离 心 30min 取上清。2. 包涵体的纯化：上述变性液上样至5 ml Ni柱，用变性液平衡，用pH 4.5的20 mM NaAc缓冲液洗涤三个柱体积，然后用含有55mM, 100mM及500mM 咪唑的含8M尿素的洗脱液阶段梯度洗脱，每个梯度至少洗五个柱体积。3. 包涵体的复性：上述洗脱液进行SDS-PAGE鉴定，然后用变性液调节其浓度 至0.5 mg/ml左右。再透析至含有4M尿素的复性液中，1OC透析6 h,然后 透析至含有2 M尿素的复性液中，透析8 h；再透析至含有1M尿素的复性液 中，透析12h;最后透析至储存缓冲液(20 mM Tris-HCl. 50 mM NaCl ,20 % 甘 油, pH 8.0)中。 5000 rpm 离心 10 min, 取上清进行还原胶及非还原胶鉴定， 并进行酶学性质检测。
