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1、植物药中检测黄曲霉毒素IACHPLC方法研究 分类号: 单 位代码:10389 密 级: 学 号:1106004 福 建 农林 大学 硕士 学 位论 文 植 物药中 检测 黄曲霉 毒素IAC-HPLC方 法的研 究 学 科 门 类: 医 学 一级学科 名称: 药 学 二级学科 名称: 生药学 研 究 方 向: 中药现 代化及 资源开 发 与 质量研究 研 究 生 姓 名 : 阮 颖 慧 指 导 教 师: 林光美 教授 完 成 时 间: 二一 三年四 月 University Code : Classification No. : Confidentiality : Student No. :
2、Determinacion of Aflatoxins in Traditional Chinese Herbal Medicine by IAC-HPLC Technology Medicine Discipline : Subject : science of Chinese traditional medicine Specialty : pharmacognosy The modernization of traditional Chinese Research field : medicine and resource development research Postgraduat
3、e : Ruan YinghuiSupervisor : Professor Lin Guanmei April, 2013 Submitted Date :独创性声明本人声明,所呈交的学位(毕业)论文,是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果,并且是自己撰写的。尽我所知,除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外,论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志,都在论文中作了明确的说明并表示了谢意,如被查有侵犯他人知识产权的行为,由本人承担应有的责任。学位(毕业)论文作者亲笔签名: 日期:论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位(毕业)论文的规
4、定,即学校有权送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅; 学校可以公布论文的全部或部分内容,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密,在 年后解密可适用本授权书。 不保密,本论文属于不保密。学位(毕业)论文作者亲笔签名: 日期:指导教师亲笔签名: 日期:目录摘要I Abstract III 第一章 引言 1 1 黄曲霉毒素概述1 1.1 理化性质. 1 1.2 毒性及危害 3 1.3 限量标准. 5 1.4 检测方法. 7 1.5 脱毒方法10 1.6 预防措施12 2 中药材中黄曲霉毒素检测研究进展13 3 展望. 16 第二章 植物药中检测黄曲霉毒素 IAC-HPLC方法研究. 18
5、 1 材料与方法18 1.1 试验材料与试剂18 1.2 试验仪器和设备19 1.3 试液的配制. 19 1.4 试验的内容与方法20 1.5 试验结果计算 23 2 结果与分析24 2.1 黄曲霉毒素 B 、B 、G 、 G 标准品实际浓度测定24 1 2 1 22.2 提取液浓度的选择25 2.3 提取方式的选择26 2.4 IAC 淋洗液的选择27 2.5 衍生方式选择 28 2.6 流动相的选择 34 i2.7 方法学考察. 35 2.8 样品检测38 3 本章讨论 44 4 本章小结 45 第三章 不同品牌 IAC性能测试及选择 46 1 材料与方法46 1.1 试验材料与试剂46
6、1.2 试验设备与仪器46 1.3 试液的配制. 47 1.4 试验内容与方法47 1.5 试验结果计算 50 2 结果与分析50 2.1 柱容量 50 2.2 柱回收率50 2.3 甲醇和乙腈的耐受性. 52 2.4 洗脱液浓度与体积的确定54 2.5 pH值变化对免疫亲和柱吸附效果的影响55 2.6 上样流速的确定56 2.7 洗脱时间的确定57 2.8 活化再生时间的确定. 57 2.9 柱重复使用性和稳定性 58 3 本章讨论 59 第四章 中药炮制对黄曲霉毒素的影响. 60 1 材料与方法60 1.1 试验材料与试剂60 1.2 试验设备与仪器60 1.3 试验内容与方法61 2 结
7、果与分析62 2.1 培养天数选择 62 ii2.2 净制. 63 2.3 炒制. 63 2.4 麸制. 64 2.5 蜜制. 64 2.6 酒制. 65 2.7 盐制. 66 3 本章讨论 66 第五章 结论与展望68 1 结论. 68 2 创新之处 69 3 展望. 70 参考文献. 71 致谢77 iii 福建农林大学硕士学位论文 植物药中检测黄曲霉毒素 IAC-HPLC方法的研究 摘要 黄曲霉毒素Aflatoxins,简称 AFT是目前已知作用最强的基因毒性物质和致癌物质,在高温、高湿环境下,极易产生且不易去除。我国药材种植、加工、运输、存储过程中,稍有不慎,极易染毒。本研究建立了适合
8、于普遍植物药材进行黄曲霉毒素检测的 IAC-HPLC法,并运用该法对福州各大药店的 11种药材(甘草、当归、泽泻、山药、绞股蓝、鱼腥草、麦冬、枸杞子、三七花、红花、山楂)进行黄曲霉毒素污染调查,为完善的限量标准及检测方法提供科学参考。研究内容如下: 1.对中药材中黄曲霉毒素检测步骤的前处理、净化、衍生方式、色谱条件进行探索、优化,成功建立植物药材中检测黄曲霉毒素的高效液相法。该法以信噪比 S/N31(N噪声,S被测物信号/单位体积)作为最低检出限。黄曲霉毒素AFB 、 AFB 、 AFG 和 AFG 的最低检测限分别为 0.1、 0.02、 0.05和 0.05 g/kg 。1 2 1 2以目
9、前最严格的欧盟限量标准 AFB 2g/kg,此方法能满足现在国际上越来越严1格的黄曲霉毒素限量的检测要求。以甘草为基质,加标水平在 0.58ng/mL范围内,线性方程为:Y 37959X+669.33(r0.9999 );Y 81720X+2225.8(r0.9999 ); B1 B2Y 35430X+1821.6(r0.9999 );Y 18884X+654.04(r0.9999 ); G1 G2除 AFG 外加标回收率在 62%88%,其余加标回收率在 74%108%,日内和2日间 RSD为 1.0211.7%,1.53%6.21%,结果证明该方法准确、可靠,适用于中药材中黄曲霉毒素的检测
10、。 2. 在黄曲霉毒素检测步骤中,净化是重要一环,本实验对净化用免疫亲和柱进行效能比较及最佳使用条件进行研究。本实验选用 Vicam、Clover、Romer、华安麦科公司的这四种目前最常使用的黄曲霉毒素总量柱进行研究,结果表明:Vicam、Clover、Romer、华安麦科的黄曲霉毒素总量柱,最大承受 AFB 的柱容1量分别为:355ng、287ng、602ng、475ng。Romer的加标回收率好于其他,平均达 107%。免疫亲和柱的上样的甲醇和乙腈耐受度分别在 20%和 10%以下; Cover 和华安麦科公司产的 IAC 柱 pH值在 7.0是为吸附最优,Vicam和 Romer公司产
11、 IAC 柱 pH值分别在 7.2和 7.4为吸附最优。各种品牌免疫亲和柱的重复利用中,活化时间均要求大于 18小时。各品牌 IAC柱均可重复使用 13次且吸附I 福建农林大学硕士学位论文 植物药中检测黄曲霉毒素 IAC-HPLC方法的研究 率均在 90%以上,3次重复使用后回收率不同程度减低,其中在吸附率可使用范围内,华安麦科公司的 IAC重复使用次数可达到 7次。 3. 研究不同炮制方法对中药材中黄曲霉毒素含量的影响。实验结果表明:净制前后对比,黄曲霉毒素减少率达75%;加热炮制(炒制)对药材中黄曲霉毒素几乎没有影响;蜜制药材容易滋生黄曲霉毒素;酒制、盐制对药材,黄曲霉毒素均有不同的减少,
12、但是无法彻底去除。关键词:植物药材;黄曲霉毒素;高效液相色谱II 福建农林大学硕士学位论文 植物药中检测黄曲霉毒素 IAC-HPLC方法的研究 Abstract Aflatoxins is currently the strongest known genetic toxic substances and carcinogenic substances, under high temperature and high humidity environment, easy to produce and not easy to remove. Traditional Chinese Herbal
13、Medicine in planting, processing, transportation and storage process, carelessly a bit, is easily infected. This research through the use of IAC - HPLC detection method study of Aflatoxins contamination in Traditional Chinese Herbal Medicine , Used in the Glycyrrhiza uralensis, Lycium barbarum L, Ra
14、dix AngelIACe Sinensis, Dioscorea opposita and so on, to establish and improve the standard of set limit to provide a scientific reference and detection methods, The main content is as follows: 1Aflatoxins in traditional Chinese medicinal materials before treatment, purifIACtion, and chromatographic
15、 conditions , the columnderivatization way to optimize exploration , and successfully create for detection of IAC - HPLC. The limit of detection LOD,RSN 3 was 0.1, 0.1, 0.05 and 0.05g/ kg for Aflatoxins B , B , G 1 2 1and GThe most stringent Evaluation standard limits for permissible levels of AFB 2 12g/kg, An excellent linear ralationship between peak area anf AFT concentration was 0.5 8 ng/
