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1、编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第1页 共1页胞核胞浆胞膜制备试剂盒 Nucl-Cyto-Mem Preparation Kit货号：P060004描述：从哺乳动物新鲜或冻存的组织块、贴壁或悬浮培养细胞中，制备细胞核、细胞膜与胞内质膜、细胞浆等三种主要亚细胞组分。独特的试剂成分与优化的制备方案相结合，使胞核-胞膜-胞浆制备过程简单易行，无需特殊设备和超速离心，制备过程可在1小时内完成。制备的细胞核、细胞浆组分纯度甚高，而且较少交叉污染。单一的细胞膜的纯化是一个特殊问题，本试剂盒制备的胞膜是细胞膜和细胞器如线粒体、内质网、高尔基体及其质膜的混合物。制备的细胞核是
2、完整的未裂解的细胞核，但胞浆组分为可溶性胞浆蛋白。制备的亚细胞组分的纯度可胜任后续免疫共沉淀、SDS-PAGE、2-D gel电泳、Western Blotting、酶活性测定、受体分析等。组成：(50 extractions, 8 x 106 cells per extraction)CER, Cytosol Extraction Reagent，25ml; MER, Membrane Extraction Reagent，2.5 mlNER, Nuclear Extraction Reagent，50 ml;Suspension Buffer，10 ml 储存：4 C避光保存1年。收集细胞
3、：准确计数，每一制备使用等量的细胞数，将明显改善后续检测结果的一致性。每一制备约需要8 x 106 1 x 107个细胞。贴壁细胞：PBS冲洗细胞皿，胰蛋白酶消化细胞。800 x g 离心5-10 min。弃上清，用PBS重悬洗涤细胞并再次离心收集细胞。注意：为避免胰蛋白酶在后续制备过程中降解蛋白质，可用无酶细胞消化液(Non-enzyme Cell Disassociation Solution)使贴壁培养的细胞与瓶皿分离。悬浮细胞：800 x g 离心5-10 min。弃上清。用PBS重悬洗涤细胞并再次离心收集细胞。估计细胞沉淀压积PCV (packed cell volume)：通常1
4、x 106 个细胞离心后的PCV约为10-20 ml，1 x 107 个细胞的PCV约为100 ml。注意PCV大小与细胞数量有关，也与细胞类型、大小、离心速度有关。制备步骤 制备全程在4 C或冰水浴中进行。1.1 细胞匀浆裂解每1 x 107个细胞或100 ml PCV的细胞沉淀加入500 ml CER试剂，震荡重悬。冰浴2 min。将细胞悬液转移到冰预冷的玻璃匀浆器内。冰上上下手动匀浆20-30次。注意：破碎细胞是关键环节。用1-3 ml小容积玻璃匀浆器，须选用间隙严密的研杵，其特征是将研杵插入匀浆器套管后，可提起研杵而套管不会脱落。有效研磨是上下推拉研磨而不是旋转。破碎效果与细胞类型有关
5、。可在相差显微镜下检查，未裂解细胞应少于5%。1.2 组织块匀浆裂解取250 mg哺乳动物新鲜或-80 C冻存的组织块，勿剪碎为更小的块。放入冰预冷的玻璃匀浆器内。加入500 ml CER试剂。用研杵旋转将组织块捣碎，上下手动预匀浆20次。冰浴10 min。然后上下手动预匀浆7次。注意：与培养细胞特别是贴壁细胞相比，组织块中的细胞在匀浆时较易破碎，因而并非必须选用间隙严密的研杵。如果研杵与套管过于严密，组织匀浆困难，可选用研杵与套管稍松的匀浆器。破碎效果与组织细胞类型有关。可在相差显微镜下检查，未裂解细胞应少于5%。2. 取出500 ml裂解混合物，转移到1.5 ml离心管。800 g，4 C
6、离心5 min。粗细胞核沉淀在管底，上清为胞膜-胞浆混合物。按照以下步骤首先制备膜与胞浆，然后制备细胞核，或用两台离心机同时制备。3. 膜与胞浆制备：3.1. 将步骤2 获得的上清液转移到新管，估计上清液体积；3.2. 立即加入1/10积量的MER与上清液混合。冰浴5分钟；3.3. 最大转速14,000 rpm 4 C离心30分钟；3.4. 取出上清液转移到新管，此为胞浆组分；3.5. 沉淀为胞膜组分，含细胞膜和细胞内质膜的混合物。再次瞬时离心除尽液体，用100 ml或适宜体积的Suspension Buffer或自备溶液重悬胞膜。4. 细胞核制备：4.1. 加入500 ml NER，振荡重悬
7、步骤2 获得的粗核。必要时按步骤1.1匀浆胞核；4.2. 4000 g，4 C离心5 min。弃上清；4.3. 再次加入500 ml NER洗涤胞核沉淀，并重复步骤4.2，离心后的上清应清亮；4.4. 弃上清除尽液体。用100 ml或适宜体积Suspension Buffer或自备溶液重悬细胞核。说明1. 制备的胞浆组分或重悬于Suspension Buffe的胞膜胞核组分可进行Bradford法、Lowry法、BCA法蛋白定量、酶活性测定、受体分析。但进行免疫共沉淀、SDS-PAGE、2-D gel电泳、Western Blot之前，需要1:1加入自备的2x 样品缓冲液(含适宜浓度的去垢剂如
8、NP-40、Triton X-100、SDS)。用户可不用Kit中的Suspension Buffer，而直接用自行配制的样品缓冲液重悬胞核或胞浆沉淀，但这是要考虑自配缓冲液中是否有影响蛋白定量的因素。2. 用SDS-PAGE Loading 缓冲液裂解细胞核后，DNA释放会使核裂解物十分粘稠，可95 C加热5 min，高速振荡打断DNA，重复加热2-3次。3. 如果为凝胶阻滞实验(EMSA)目的提取核蛋白，建议用#P1200: 核-胞浆蛋白制备试剂盒 (Nuclear-Cytosol Extraction Kit)，该试剂盒并非提取完整的细胞核，而是直接提取可溶性核蛋白，可用于EMSA或Western Blot分析。4. 试剂盒不包含蛋白酶抑制剂。通常4 C操作不用蛋白酶抑制剂不会出现问题。第 1 页 共 1 页
