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1、干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）一. 前言二. 干细胞制剂的质量控制（一）干细胞的采集、分离及干细胞（系）的建立（二）干细胞制剂的制备（三）干细胞制剂的检验（四）干细胞制剂的质量研究三. 干细胞制剂的临床前研究（一）安全性评价（二）有效性评价名词解释参考文献一.前言干细胞是一类具有不同分化潜能，并在非分化状态下自 我更新的细胞。干细胞治疗是指应用人自体或异体来源的干 细胞经体外操作后输入（或植入）人体，用于疾病治疗的过 程。这种体外操作包括干细胞的分离、纯化、扩增、修饰、 干细胞（系）的建立、诱导分化、冻存和冻存后的复苏等过程。 用于细胞治疗的干细胞主要包括成体干细胞、胚胎干细胞
2、及 诱导的多能性干细胞（iPSC） 成体干细胞包括自体或异体、 胎儿或成人不同分化组织,以及发育相伴随的组织（如脐带、 羊膜、胎盘等）来源的造血干细胞、间充质干细胞、各种类型 的祖细胞或前体细胞等。目前国内外已开展了多项干细胞（指非造血干细胞）临 床应用研究，涉及多种干细胞类型及多种疾病类型。主要疾 病类型包括骨关节疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反应 （GVHD ）、脊髓损伤及退行性神经系统疾病和糖尿病等。其 中许多干细胞类型,是从骨髓、脂肪组织、脐带血、脐带或胎 盘组织来源的间充质干细胞，它们具有一定的多向分化潜能 及抗炎和免疫调控能力等.用于干细胞治疗的细胞制备技术和治疗方案，具有多样 性、
3、复杂性和特殊性。但作为一种新型的生物治疗产品，所 有干细胞制剂都可遵循一个共同的研发过程,即从干细胞制 剂的制备、体外试验、体内动物试验,到植入人体的临床研究 及临床治疗的过程。整个过程的每一阶段,都须对所使用的干 细胞制剂在细胞质量、安全性和生物学效应方面进行相关的 研究和质量控制.本指导原则提出了适用于各类可能应用到临床的干细 胞（除已有规定的造血干细胞移植外）在制备和临床前研究阶 段的基本原则。每个具体干细胞制剂的制备和使用过程，必 须有严格的标准操作程序并按其执行，以确保干细胞制剂的 质量可控性以及治疗的安全性和有效性。每一研究项目所涉 及的具体干细胞制剂,应根据本指导原则对不同阶段的
4、基本 要求，结合各自干细胞制剂及适应证的特殊性，准备并实施 相关的干细胞临床前研究。二。干细胞制剂的质量控制（一）干细胞的采集、分离及干细胞（系）的建立1. 对干细胞供者的要求每一干细胞制剂都须具有包括供者信息在内的、明确的 细胞制备及生物学性状信息。作为细胞制备信息中的重要内 容之一,需提供干细胞的获取方式和途径以及相关的临床资 料，包括供者的一般信息、既往病史、家族史等.既往史和家 族史要对遗传病（单基因和多基因疾病，包括心血管疾病和肿 瘤等）相关信息进行详细采集。对用于异体干细胞临床研究 的供者,必须经过检验筛选证明无人源特定病毒（包括 HIV、 HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV
5、 等）的感染，无梅毒螺旋 体感染必要时需要收集供者的ABO血型、HLA-I类和II类 分型资料,以备追溯性查询。如使用体外授精术产生的多余胚 胎作为建立人类胚胎干细胞系的主要来源，须能追溯配子的 供体,并接受筛选和检测。不得使用既往史中患有严重的传染 性疾病和家族史中有明确遗传性疾病的供者作为异体干细 胞来源.自体来源的干细胞供者，根据干细胞制剂的特性、来源 的组织或器官，以及临床适应证，可对供体的质量要求和筛 查标准及项目进行调整.2。干细胞采集、分离及干细胞（系）建立阶段质量控制 的基本要求应制定干细胞采集、分离和干细胞（系）建立的标准操 作及管理程序，并在符合药品生产质量管理规范GMP
6、） 要求基础上严格执行。标准操作程序应包括操作人员培训； 材料、仪器、设备的使用和管理；干细胞的采集、分离、纯 化、扩增和细胞（系）的建立；细胞保存、运输及相关保障措 施，以及清洁环境的标准及常规维护和检测等。为尽量减少不同批次细胞在研究过程中的变异性,研究 者在干细胞制剂的制备阶段应对来源丰富的同一批特定代 次的细胞建立多级的细胞库，如主细胞库（Master Cell Bank） 和工作细胞库（Working Cell Bank ）。细胞库中细胞基本的 质量要求，是需有明确的细胞鉴别特征,无外源微生物污染。在干细胞的采集、分离及干细胞（系）建立阶段，应当对 自体来源的、未经体外复杂操作的干细
7、胞，进行细胞鉴别、 成活率及生长活性、外源致病微生物，以及基本的干细胞特 性检测。而对异体来源的干细胞,或经过复杂的体外培养和操 作后的自体来源的干细胞,以及直接用于临床前及临床研究 的细胞库（如工作库）中的细胞,除进行上述检测外，还应当进 行全面的内外源致病微生物、详细的干细胞特性检测,以及细 胞纯度分析.干细胞特性包括特定细胞表面标志物群、表达产 物和分化潜能等。（二）干细胞制剂的制备1。培养基干细胞制剂制备所用的培养基成分应有足够的纯度并 符合无菌、无致病微生物及内毒素的质量标准,残留的培养基 对受者应无不良影响;在满足干细胞正常生长的情况下，不影 响干细胞的生物学活性，即干细胞的“干性
8、”及分化能力.在干 细胞制剂制备过程中，应尽量避免使用抗生素。若使用商业来源培养基 ,应当选择有资质的生产商并由其提供培养基的组成成分及相关质量合格证明。必要时,应对 每批培养基进行质量检验。除特殊情况外,应尽可能避免在干细胞培养过程中使用人源或动物源性血清，不得使用同种异体人血清或血浆.如必 须使用动物血清，应确保其无特定动物源性病毒污染。严禁 使用海绵体状脑病流行区来源的牛血清。若培养基中含有人的血液成份，如白蛋白、转铁蛋白和 各种细胞因子等，应明确其来源、批号、质量检定合格报告, 并尽量采用国家已批准的可临床应用的产品.2。滋养层细胞用于体外培养和建立胚胎干细胞及iPS细胞的人源或动 物
9、源的滋养层细胞，需根据外源性细胞在人体中使用所存在 的相关风险因素，对细胞来源的供体、细胞建立过程引入外 源致病微生物的风险等进行相关的检验和质量控制。建议建 立滋养层细胞的细胞库，并按细胞库检验要求进行全面检 验，特别是对人源或动物源特异病毒的检验。3。干细胞制剂的制备工艺应制定干细胞制剂制备工艺的标准操作流程及每一过 程的标准操作程序(SOP)并定期审核和修订；干细胞制剂的 制备工艺包括干细胞的采集、分离、纯化、扩增和传代，干 细胞（系）的建立、向功能性细胞定向分化,培养基、辅料和 包材的选择标准及使用，细胞冻存、复苏、分装和标记，以 及残余物去除等。从整个制剂的制备过程到输入（或植入）
10、到受试者体内全过程，需要追踪观察并详细记录.对不合格并 需要丢弃的干细胞制剂,需对丢弃过程进行规范管理和记录. 对于剩余的干细胞制剂必须进行合法和符合伦理要求的处 理，包括制定相关的SOP并严格执行。干细胞制剂的相关资 料需建档并长期保存。应对制剂制备的全过程，包括细胞收获、传代、操作、 分装等,进行全面的工艺研究和验证，制定合适的工艺参数和 质量标准，确保对每一过程的有效控制。（三）干细胞制剂的检验1。干细胞制剂质量检验的基本要求 为确保干细胞治疗的安全性和有效性，每批干细胞制剂 均须符合现有干细胞知识和技术条件下全面的质量要求。制 剂的检验内容，须在本指导原则的基础上,参考国内外有关细 胞
11、基质和干细胞制剂的质量控制指导原则，进行全面的细胞 质量、安全性和有效性的检验。同时，根据细胞来源及特点、 体外处理程度和临床适应证等不同情况，对所需的检验内容 做必要调整.另外，随着对干细胞知识和技术认识的不断增 加，细胞检验内容也应随之不断更新。针对不同类型的干细胞制剂，根据对输入或植入人体前 诱导分化的需求 ,须对未分化细胞和终末分化细胞分别进行 必要的检验。对胚胎干细胞和iPS细胞制剂制备过程中所使 用的滋养细胞,根据其细胞来源,也需进行针对相关风险因素 的质量控制和检验.为确保制剂的质量及其可控性 ,干细胞制剂的检验可分 为质量检验和放行检验。质量检验是为保证干细胞经特定体 外处理后
12、的安全性、有效性和质量可控性而进行的较全面质 量检验。放行检验是在完成质量检验的基础上,对每一类型的 每一批次干细胞制剂，在临床应用前所应进行的相对快速和 简化的细胞检验.为确保制剂工艺和质量的稳定性 ,须对多批次干细胞制 剂进行质量检验；在制备工艺、场地或规模等发生变化时， 需重新对多批次干细胞制剂进行质量检验。制剂的批次是指 由同一供体、同一组织来源、同一时间、使用同一工艺采集 和分离或建立的干细胞。对胚胎干细胞或iPS细胞制剂，应 当视一次诱导分化所获得的可供移植的细胞为同一批次制 剂.对需要由多个供体混合使用的干细胞制剂，混合前应视每 一独立供体或组织来源在相同时间采集的细胞为同一批次
13、 细胞。对于由不同供体或组织来源的、需要混合使用的干细胞 制剂，需对所有独立来源的细胞质量进行检验，以尽可能避 免混合细胞制剂可能具有的危险因素.2. 细胞检验2.1 质量检验(1) 细胞鉴别应当通过细胞形态、遗传学、代谢酶亚型谱分析、表面 标志物及特定基因表达产物等检测，对不同供体及不同类型 的干细胞进行综合的细胞鉴别。(2) 存活率及生长活性采用不同的细胞生物学活性检测方法，如活细胞计数、 细胞倍增时间、细胞周期、克隆形成率、端粒酶活性等，判 断细胞活性及生长状况。(3) 纯度和均一性通过检测细胞表面标志物、遗传多态性及特定生物学活 性等，对制剂进行细胞纯度或均一性的检测。对胚胎干细胞 及
14、 iPS 细胞植入人体前的终末诱导分化产物，必须进行细胞 纯度和/或分化均一性的检测。对于需要混合使用的干细胞制剂，需对各独立细胞来源 之间细胞表面标志物、细胞活性、纯度和生物学活性均一性 进行检验和控制。(4) 无菌试验和支原体检测应依据现行版中华人民共和国药典中的生物制品无 菌试验和支原体检测规程,对细菌、真菌及支原体污染进行检 测.5)细胞内外源致病因子的检测应结合体内和体外方法 ,根据每一细胞制剂的特性进行人源及动物源性特定致病因子的检测。如使用过牛血清，须 进行牛源特定病毒的检测；如使用胰酶等猪源材料,应至少检 测猪源细小病毒;如胚胎干细胞和 iPS 细胞在制备过程中使 用动物源性滋
15、养细胞，需进行细胞来源相关特定动物源性病 毒的全面检测。另外还应检测逆转录病毒。（6）内毒素检测 应依据现行版中华人民共和国药典中的内毒素检测 规程，对内毒素进行检测。（7）异常免疫学反应检测异体来源干细胞制剂对人总淋巴细胞增殖和对不 同淋巴细胞亚群增殖能力的影响 ,或对相关细胞因子分泌的 影响，以检测干细胞制剂可能引起的异常免疫反应。（8）致瘤性对于异体来源的干细胞制剂或经体外复杂操作的自体 干细胞制剂，须通过免疫缺陷动物体内致瘤试验，检验细胞 的致瘤性。（9）生物学效力试验可通过检测干细胞分化潜能、诱导分化细胞的结构和生 理功能、对免疫细胞的调节能力、分泌特定细胞因子、表达 特定基因和蛋白
16、等功能，判断干细胞制剂与治疗相关的生物 学有效性。对间充质干细胞，无论何种来源，应进行体外多种类型 细胞(如成脂肪细胞、成软骨细胞、成骨细胞等)分化能力 的检测，以判断其细胞分化的多能性(Multipotency)。对未分 化的胚胎干细胞和 iPS 细胞，须通过体外拟胚胎体形成能力, 或在 SCID 鼠体内形成畸胎瘤的能力，检测其细胞分化的多 能性(Pluripotency)除此以外，作为特定生物学效应试验, 应进行与其治疗适应证相关的生物学效应检验.(10) 培养基及其他添加成分残余量的检测 应对制剂制备过程中残余的、影响干细胞制剂质量和安 全性的成分,如牛血清蛋白、抗生素、细胞因子等进行检测.2。2 放行检验 项目申请者应根据上述质量检验各项目中所明确的检 验内容及标准，针对每一类型干细胞制剂的
