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1、授课对象： 06级检验 1-5 班课时：2 学时缓冲液离子强度对电泳速度的影响目标： 1.阐述电泳的基本原理及注意事项。2.初步掌握电泳技术（以血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳为例）3.观察并比较不同缓冲液离子强度对电泳速度的影响。实验用品：电泳仪，电泳槽，醋酸纤维薄膜（齿小镊子，pH8.6 （I0.06 和 0.03）2X 8cm）,点样器（X胶片），滤纸，无 的巴比妥缓冲液等。试 剂：的巴比妥缓冲液：巴比妥钠12.76g巴比妥1.66g蒸馏水1000ml的巴比妥缓冲液：巴比妥钠6.38g巴比妥0.83g蒸馏水1000ml或用的巴比妥缓冲液加蒸馏水稀释一倍即成。3. 氨基黑 10B 染色液：氨基黑
2、10B0.5g冰醋酸10ml乙醇50ml蒸馏水100ml4. 漂洗液：乙 醇45ml冰醋酸5.0ml蒸馏水50ml实验原理：由于血清中各种蛋白质等电点（pl）不同，所以在同一 PH8.6缓冲液中电离程度不 同，因而带电荷的多少不同。再则不同蛋白质其分子大小、形状等差异，把它放入同 一电场中其电泳的迁移率（是指带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度）不同而分离。 蛋白质分子大而带电荷少的移动速度慢，如此将血清蛋白从正极到负极依次分为 A、a、 a、$ 丫五个区带，经染色、漂洗、脱色，然后用分光光度计比色，得到各区带的值，通过D值计算出各蛋白质的相对百分含量，并可得A/G比值。操作步骤：1. 一般电泳
3、装置：示教2. 电泳操作： 酸纤维薄膜的准备：在距一端 1.5cm 处用铅笔画一条细线，然后浸泡于 I0.06pH8.6 的巴比妥缓冲液或 I0.03pH8.6 的巴比妥缓冲液中约 20min。 取出，用滤纸吸走多余的缓冲液。 用点样器蘸取血样点于薄膜上。 将点好样的薄膜置于电泳槽上，点样面朝下，点样端置电场中的负极。 电泳：电压110160V、时间3540分钟。 染色：氨基黑10B或丽春红S染液染色23分钟。 漂洗： 34 次，背景变白，图象清晰。结果观察与分析：1. 比较用 I=0.03 和 I=0.06 的缓冲液进行电泳时的结果，观察图形，判断用哪种离 子强度好。2. 利用所记录的电泳电
4、压（V），支持物有效长度（CM），电泳时间（S）和清蛋 白移动距离（ CM ） ，分别计算用离子强度 0.03和 0.06的清蛋白迁移率，判断离子强度 对电泳速度的影响。探迁移率（Q是指带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度（V ）。即：卩=V/E=QE/6冗 丫 nV=QE2/6 冗中爪 V=D/T （CM/S）（T 时间 D 移动距离 cm ）E=V/L（V/cm） （V 电压 L支持物有效长度）2卩=V/E=（ D/T） /（V/L）=DL/VT （cm 2/vs）结论 ：离子强度增加，缓冲液所载的分电流也随之增加，样品所载的分电流则降低，因 此，样品的电泳速度减慢；同时离子强度增加使电泳时的总电流和产热也增加，对电泳不利。在低离子强度时，缓冲液所载的分电流下降，样品所载的分电流增加，且介 质粘度系数降低等因素，均增加了样品的电泳速度，而电泳系统总电流和产热也减少 但样品在支持物上扩散严重，分辨率明显下降，同时离子强度小，缓冲能力弱，溶液 PH 稳定性就差。因此，对缓冲液离子强度的选择要兼顾这两方面的因素，一般在 0.050.10mol/L 之间为好。课后小结：
