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1、免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是：当抗原与抗体 在特殊稀释系统中反应而且比例合适（一般规定抗体过量）时，形成的可溶性 免疫复合物在稀释系统中的促聚剂（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出， 形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的 量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定 反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。抗体（Ab）与可溶性抗原（Ag）反应，形成一定结构的免疫复合物，成为 悬浮于反应溶液中的微粒。在沉淀反应中形成的复合物微粒具有特殊的光 学性质，可用仪器检测，提高了检测的速度、灵敏度和易操作性。免疫比浊测
2、定注意事项：1、抗原或抗体量大大过剩，可出现可溶性复合物，造成误差。2、应维持反应管中抗体蛋白始终过剩。3、易受到脂血的影响。分类1. 免疫透射比浊法抗原抗体结合后，形成免疫复合物，在一定时间内 复合物聚合出现浊度。当光线通过溶液时，可被免疫复合物吸收。免疫复 合物量越多，光线吸收越多。光线被吸收的量在一定范围内与免疫复合物 的量成正比。利用比浊计测定光密度值，复合物的含量与光密度值成正比， 同样当抗体量一定时，光密度值也与抗原含量成正比。本法较单向琼脂扩 散试验和火箭电泳等一般免疫化学定量方法敏感、快速简便，但要求免疫 复合物的数量和分子量达到一定高度，否则就难以测出。2. 免疫散射比浊法一
3、定波长的光沿水平轴照射，通过溶液使遇到抗原 抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发 射光的波长和抗原抗体复合物颗粒大小和多少密切相关。散射光的强度与 复合物的含量成正比，即待测抗原越多，形成的复合物也越多，散射光也 越强。散射光的强度还与各种物理因素，如加入抗原或抗体的时间、光源 的强弱和波长、测量角度等密切相关。散射比浊法又分为速率散射比浊法 和终点散射比浊法。3. 免疫胶乳比浊法胶乳比浊法即是将待测物质相对应的抗体包被在 直径为15 60nm的胶乳颗粒上，使抗原抗体结合物的体积增大，光通过之 后，透射光和散射光的强度变化更为显著，从而提高试验的敏感性。实验八免疫比
4、浊法定 C-反应蛋白【原理】血清C反应蛋白（CRP）与试剂中抗人CRP抗体结合，形成免疫复合物，一 起吸光度增加，在波长340nm和700nm处测定免疫复合物浊度。根据吸光度增加量，即可定量检测血清中CRP的含量。【试剂】1.0.1 mol/L 的 Tris 缓冲液。2 .羊抗人CRP抗血清。3. CRP定标液。加入匕物空白管标准管测定管血清彳标本31)15表8-1免疫比浊法测定C反应蛋白操作步骤【操作步骤】见表8-1。CRP 定标液 31)15一生理盐水31)15缓冲液 3 1)350350350混合，于37C保温5 min，在波长340nm和700nm处读各管吸光度(A1、A1 )抗人CR
5、P抗血清 350340 弼501)混合，于37C保温5 min，在波长340nm和700nm处读各管吸光度(A2340、A2Q【计算】HDL-C含量(mmo1/L)= X标准液浓度/A=(A2 A2 ) (A1 A1 )340700340700【参考范围】血清C反应蛋白V4mg/L(各实验室应有自己的参考范围)【注意事项】1. 使用新鲜血清，并尽可能快地检测。2. 试剂不能冷冻保存。【临床意义】CRP是一种急性相蛋白，肝脏是其主要的合成器官。最近研究表明，人体其 他部位如冠状动脉平滑肌细胞、神经元细胞、血管内皮细胞、脂肪细胞、肾小管 上皮细胞等在炎症刺激或病理状态下都能合成和分泌CRP。正常情
6、况下，CRP以 微量存在于健康人的血清中，但在机体有细菌感染、组织损伤、肿瘤形成等急性 相刺激时，CRP水平可升至正常的100倍甚至更高。测定CRP对于鉴别感染、监 测疾病活动情况及严重程度、器质性疾病的筛检、监测器官移植受体排斥反应及 疗效观察、冠心病等急性血管意外事件的预测与诊治等有很好的导向作用。【评价】CRP的检测方法从灵敏度较低的免疫扩散法、火箭电泳法、胶乳凝集试验到 高灵敏度、高精密度的放射免疫、酶免疫、免疫比浊等定量试验。多数情况下， 半定量的胶乳凝集试验适合于筛查，但其影响因素多、灵敏度较差和不能精确定 量。对于需作较精确的CRP定量测定，免疫浊度法较为合适。其他方法如ELIS
7、A、 免疫发光法和化学发光法虽然灵敏度和精确度都较高，但其成本也较高，故不是 理想的临床实验室的常规方法。1材料与方法1.1兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳的制备1.1.1兔抗人白蛋白抗体的制备采用25%人血浆白蛋白注射液，按常规免疫 新西兰纯种白兔，获得兔抗人白蛋白免疫血清（效价1:32），经饱和硫酸铵沉淀 后，过DE-52层析柱，IgG峰部洗脱液用Follin酚法于540nm处定量测定IgG 蛋白含量，并用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳鉴定，仅出现一条区带。1.1.2兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳的制备取10%羧化聚苯乙烯胶乳悬液（军 事医学科学院动物中心产品，=0.6um），用pH8.2甘氨酸缓冲液（GBS）
8、稀释 成1%浓度，将其于兔抗人白蛋白IgG按适当比例混合，以常规物理吸附法致敏 胶乳。1.2敏感性试验取25%人血浆白蛋白20 ul，加入生理盐水180 ul，再经系列稀释成10个 浓度，其浓度范围在25mg/ml3.125ng/ml之间，用兔抗人免疫羧化胶乳做3次 重复检测。1.3特异性试验将牛、马、羊、豚鼠血清分别稀释至5%、2.5%和1.25%，用兔抗人白蛋 白免疫羧化胶乳检测。1.4重复性试验用四批兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳，对5份粪微量白蛋白阳性粪便标本和2 份已知浓度白蛋白溶液平行检测，并在有效期内用同一批免疫羧化胶乳先后7 次重复检测，同时设阴性对照。3讨论兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳
9、试剂对粪微量白蛋白的检测，是针对粪便中由 于病变部位出血后的血浆蛋白，或组织渗出液中的白蛋白。而检测粪微量白蛋白 作为大肠肿瘤的筛检手段之一，最早是在1987年，日本中山拓郎等曾用ELISA 法对粪潜白蛋白(O ccultalbmin)进行定量检测，并认为其敏感性优于便潜血。1993年，我们制备和建立了兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳试剂和反向胶乳凝集试 验，检测了 378例已知患者和正常人粪便标本，其临床结果显示：56例大肠癌 诊断敏感性55.4%，特异性82.6%； 132例正常人阳性率17.4%。近来我们增加 了已知患者数量，重新检测了 161例正常人粪微量白蛋白，结果表明：在增加受 检人数后，
10、提高了大肠癌的诊断敏感性(76.8%)，而特异性则无显著差别(80.0%)； 161例正常人阳性率为19.2%，比原来的132例正常人阳性率高1.8%。 实验结果显示：在受检人数增多的情况下，用该试剂检测粪微量白蛋白可能会达 到提高诊断敏感性，保持特异性的良好效果。C-反应蛋白检测试剂盒(全量程)试制工作总结一、概述C反应蛋白(C-reactive protein)是一种能与肺炎链球菌C多糖体反应形成 复合物的急性时相反应蛋白，半衰期19小时；血清CRP由肝脏合成，白细胞 介素1b、6以及肿瘤坏死因子是其合成的最重要的调节因子；CRP的分子量为 105 500，由含有五个相同的未糖基化的多肽亚
11、单位组成，每个亚单位含有187 个氨基酸，这些亚单位间通过非共价键连结成环状的五聚体，并有一个链间二硫 键。1930年，Tillett和Francis首次在急性大叶性肺炎患者的血清中发现一种能 在 Ca2+存在时与肺炎球菌细胞壁中的C一多糖发生特异性沉淀反应的物质。1941 年，Avery等测知它是一种蛋白质，故称为C反应蛋白(CRP)。1944年，Jones 将其作为临床风湿热诊断标准的次要指标之一。后来，人们在非感染性疾病和感 染性疾病患者的急性期血清中都测到了 CRP，于是人们认为，CRP是组织损伤 的一种非特异性反应。进一步研究发现：病毒或细菌感染、梗塞、免疫复合物沉 积等因素都可导致
12、组织损伤。在组织损伤的急性期，肝脏合成的一些血浆蛋白显 著增加，这些蛋白质通称为急性时相蛋白，其中CRP是急性时相蛋白中变化最 显著的一种。CRP在正常人血清中其含量极微；在组织受到损伤、炎症、感染 或肿瘤破坏时CRP可以在数小时内急剧上升，可增高数倍或数百倍，2-3天达 峰值，待病情改善时逐渐下降，恢复正常。CRP被广泛应用于临床疾病的早期 诊断及鉴别诊断，其升高可见于：1、组织损伤、感染、肿瘤、心肌梗塞及一系 列急慢性炎症性疾病，如风湿性关节炎、全身性血管炎、多肌痛风湿病；2、术 后感染及并发症的指标：手术后病人CRP升高，术后7-10天CRP水平应下 降，如CRP不降低或再次升高，提示可
13、能并发感染或血栓栓塞；3、可作为细 菌性感染和病毒性感染的鉴别诊断：大多数细菌性感染会引起患者血清CRP升 高，而病毒性感染则多数不升高。超敏 C 反应蛋白(High sensitivity C-reactive protein)与 CRP 并不是两种 蛋白，只是从灵敏度上加以区分，超敏C反应蛋白(Hs-CRP)最低检测限达0.1 mg/l;原先认为CRP是正常的血清却发现同未来发生心血管疾病密切相关，大量 研究资料表明，动脉粥样化的血栓去除了是脂肪堆积的过程外也是一个慢性炎症 过程,；Hs-CRP轻度升高与冠状动脉事件、中风及周围血管病相关，是一项独 立的危险因素；HS-CRP已被证实是由慢
14、性炎症引发心血有较高的灵敏度但线 性较低，这样就出现了一种试剂两种名称，用途也有所区别；近几年来，随着检 验技术的发展，开始出现了一种全量程CRP，这种CRP即能满足较高的灵敏度， 又能满足较高的线性，如日本一化，申索佑福等，我公司通过与中科院上海生物 研究所合作，近期已完成全量程CRP的试制，经公司自检与医院试用，结果表 明与免疫散射比浊法一致性好；公司已计划于近期完成临床与注册，正式推向市场；二、国内外研究情况2.1临床研究CRP作为一种急性时相反应蛋白，被广泛应用于临床。2.1.1用于细菌和病毒感染的鉴别诊断当细菌感染引发炎症，在炎症进程开始47小时就可开始升高，且升高的 幅度与细菌感染
15、的严重程度相一致，病毒感染时CRP不增高，以此鉴别感染的 性质，指导临床治疗，减少不管疾病的独立危险因素，检测其浓度对心血管疾病 的干预及预后起重要作用而被临床重视。流行病学调查也显示,hs-CRP水平升 高者发生急性脑卒中的几率是正常健康人的2倍，发生心肌梗死的几率是正常 者的3倍。2003年欧洲高血压防治指南（ESH/ESC）正式推荐，高血压患者 需检测hs-CRP水平。目前国内用于全自动生化仪的免疫透射比浊法试剂CRP出现了两种（普 通CRP与超敏CRP），普通 CRP有较高的线性但灵敏度不好，超敏CRP必要 的抗生素治疗，有效防止抗生素的滥用。这些感染临床上常见于肺炎、支气管炎、 咽喉
16、炎、细菌性脑膜炎、伤寒、化脓性关节炎、尿路感染、骨盆炎、阑尾炎等等。 在鉴别细菌或病毒感染方面，比白细胞计数及分类计数更准确，特别是老年人， 免疫系统反应顺应性下降，可能有感染发生但临床上并无发热、白细胞升高等情 况，此时检测CRP有助于检出细菌感染。2.1.2肿瘤监测CRP的测定用于肿瘤的治疗和预后：CRP术前上升，术后下降，不受放疗、 化疗和皮质激素治疗的影响，有助于临床评估肿瘤的进程。2.1.3监控病情变化及术后感染，并用于抗生素疗效观察CRP在血中升高的幅度与感染的程度正相关。有研究表明，术后6小时左 右，CRP开始升高，如无并发症应在术后三天下降直至正常，如术后出现感染， 则CRP长
