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1、多房棘球绦虫混合重组BCG【关键词】多房棘球绦虫；重组BGInhibitinnapptsisfsplenytesinieiunizedithixedrBGE/3andrBGE1433vaineagainstEhinusultilularis【Abstrat】AI:TiunizeieithixedrBGE/3andrBGE1433vaineagainstEhinusultilularis(E)andtinvestigatetheapptsisfspleenellshallengedithEprtslees.ETHDS:Balb/ieerevainatedsubutaneuslyandintran
2、asallyithixedrBGvainesrespetively.EighteeneeksafterhallengedithEprtsleestheieerekilledttakethespleen.Thespleenellsereislatedteasureappttiratebyflytetry.Blankvetr,BGandPBSservedasntrls.RESULTS:AppttirateintheiunizatingrupaslerthanthatinthePBSntrlgrup(P0.01).NLUSIN:Apptsisfspleenellsinieaybeinduedbyin
3、fetinithalvelarhydatidyst,butitanbeinhibitedbyiunizatinithixedrBGE/3andrBGE1433vaine.【Keyrds】Ehinusultilularis;rBGEII/3vaine;rBGE1433vaine;spleen/ytlgy;apptsis【摘要】目的：多房棘球绦虫混合重组BGE/3和BGE1433疫苗免疫小鼠并以E原头节攻击后讨论以上疫苗对小鼠脾细胞凋亡的变化.方法：将混合重组BG疫苗采用皮下注射和鼻腔内接种分别免疫Balb/鼠8k后，用多房棘球绦虫原头节进展攻击感染，感染18k杀鼠取脾并别离脾细胞，流式细胞仪检测
4、脾细胞的凋亡发生率，同时设有空载体、BG和PBS对照.结果：疫苗接种组的脾细胞凋亡发生率明显低于感染对照组.结论：泡球蚴感染可引起小鼠脾细胞凋亡，而多房棘球绦虫混合重组BGE/3和BGE1433疫苗可在一定程度上抑制感染鼠脾细胞的凋亡.【关键词】多房棘球绦虫；重组BGE/3疫苗；重组BGE1433疫苗；脾/细胞学；细胞凋亡0引言Aeisen等1认为某些寄生虫感染诱导的凋亡在疾病的发病机制中起重要作用.人们发现小鼠感染恶性疟原虫(Plasdiufaliparu)或日本血吸虫(shistsajapniu)以及大鼠感染卡氏肺孢子虫(pneuystisarinii)后均可诱导其脾细胞发生凋亡2-4.泡
5、型包虫病(alvelarehinsis,AE)是由多房棘球绦虫(Ehinusultilularis,E)的中绦期幼虫寄生在人体肝脏引起的一种严重危害人类安康的人畜共患寄生虫病.当前分子生物学技术的开展为研制理想的E疫苗提供了新方法，将E外源DNA引入特定疫苗载体构建重组活疫苗可将保护性抗原传递至宿主免疫系统.王昌源等5发现E/3重组抗原ELP蛋白是一种有较好保护性免疫力的抗原分子.SilesLuas等6证实E1433抗原位于E原头蚴的生发层，其过度表达与原头蚴的进展性、侵入性和无限制生长特性有关，提示它是一种有希望的疫苗分子.irill等7认为卡介苗BaillealetteGuerin,BG是
6、一种理想的疫苗载体.atsu等8在BG中成功构建了外源抗原分泌系统，这为开展BG成为多价疫苗载体打下了坚实的根底.本实验我们在成功构建重组BGE/3和BGE1433疫苗的根底上9-10，等量混合以上两种疫苗作为混合疫苗免疫小鼠,原头节攻击免疫鼠并观察其脾细胞凋亡的情况，从而为研究该疫苗的保护性免疫机制提供有价值的实验数据.1材料和方法1.1材料65只雌性Balb/小鼠，1214周龄，体质量2025g，购自重庆医科大学实验动物中心；多房棘球绦虫重组BGE/3和BGE1433疫苗由本室构建9-10，将rBGE/3和rBGE1433疫苗按11的浓度比例混匀，组成混合疫苗；nA购自Siga公司.Ann
7、exinVFIT试剂盒(LHK601100)购自深圳晶美生物工程公司.1.2方法1.2.1实验分组65只雌性Balb/小鼠随机分为5组，每组13只.第1组为5106fu混合疫苗悬浮于100LPBS于小鼠后背部皮下单次注射；第2组为5105fu疫苗悬浮于10LPBS于小鼠鼻腔黏膜单次接种；第3组为5106fu的空载体含pBG质粒的BG皮下单次注射对照组；第4组为5106fu的BG皮下单次注射对照组；第5组为100LPBS皮下单次注射对照.1.2.2攻击感染多房棘球绦虫混合重组BGE/3和重组BGE1433疫苗免疫8k后用50个泡球蚴原头节腹腔内注射进展攻击.对照组的攻击方案同免疫组.1.2.3脾
8、细胞制备攻击感染后18k剖杀各组小鼠，750L/L乙醇消毒、无菌取脾脏、匀浆、200目尼龙网过滤；灭菌双蒸水溶解红细胞后，用含100L/L灭活小牛血清的RPI1640培养液调整细胞浓度为5109/L，并参加青霉素1105U/L和链霉素1105U/L；台盼蓝染色后发现脾细胞存活率为93%97%.1.2.4脾细胞培养将别离的小鼠脾细胞参加24孔细胞培养板，每个标本设2孔，分别参加原液、10g/LnA各1L,3750L/L2培养1216h.1.2.5AnnexinVFIT染色法检测小鼠脾细胞凋亡培养1216h后，搜集5109/L脾细胞，用4预冷的PBS洗细胞两次，2500r/in离心5in；用250
9、L结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度至1109/L；取100L的细胞悬浮液参加5L流式细胞管中，参加AnnexinVFIT5L和20g/L碘化丙锭溶液10L；混匀后室温避光孵育15in；在反响管中加400LPBS，用流式细胞仪(美国BetnDikinsn公司)记录FIT标记的凋亡细胞在波长为495n紫外光激发下产生525n的绿色荧光以及PI标记的凋亡细胞和坏死细胞在波长为340n的紫外光激发下产生620n的红色荧光，用ellQuest软件分析细胞凋亡.统计学处理：各免疫组小鼠脾细胞凋亡发生率采用SPSS11.0软件进展分析，计量资料采用xs表示，组间比拟采用方差分析，组间两两比拟用SNK法.2
10、结果2.1原液组脾细胞凋亡当脾细胞不用任何刺激物时，5106fu混合rBG疫苗皮下注射免疫小鼠后，脾细胞凋亡发生率与PBS对照组相比降低P0.01；5105fu混合疫苗鼻腔内接种免疫小鼠后，脾细胞凋亡发生率低于PBS对照组P0.01；皮下注射组的脾细胞凋亡发生率与鼻腔内接种组相比差异无统计学意义P0.05；空载体和BG皮下注射组的脾细胞凋亡发生率分别与PBS对照组相比无统计学差异P0.05，表1.表1重组BGE/3和BGE1433疫苗免疫，原头节攻击后小鼠脾细胞凋亡检测略2.2nA刺激组脾细胞凋亡变化当脾细胞用nA刺激培养时，皮下注射组和鼻腔内接种组的脾细胞凋亡发生率低于PBS对照组P0.01
11、；鼻腔内接种组的脾细胞凋亡发生率低于皮下注射组P0.01；空载体和BG皮下注射组的脾细胞凋亡发生率分别与PBS对照组相比差异无统计学意义P0.05，表1.3讨论碘化丙啶(prpidiuidide,PI)是一种DNA染料，可特异性与DNA结合，但其不能透过细胞膜.由于凋亡细胞的膜通透性增加，因此可着染PI.当用荧光激活细胞分检器flureseneativatedellsrter,FAS检测时，着染PI的凋亡细胞在一定压力下，通过壳液包围的进样管进入流动室，排成单列细胞，经流动室的喷嘴喷出形成细胞液流.在波长为340n紫外光激发下产生波长为620n的红色荧光信号，经过计算机处理形成荧光直方图.凋亡
12、细胞信号出现于亚G1蜂上，但只代表G0/G1期发生凋亡的细胞，而不能检测S期和G2期发生凋亡的细胞；在单细胞悬液制备过程中，易产生大量细胞碎片，晚期凋亡细胞经洗涤处理可引起胞内DNA丧失，造成亚G1峰前移，与碎片峰交融在一起，因此不能区分凋亡细胞和碎片；同时坏死细胞也可着染PI，因此也不能区分凋亡细胞和坏死细胞.AnnexinVFIT染色法可弥补PI染色法的缺乏，早期凋亡细胞因细胞膜的磷脂对称性改变而使磷脂酰丝氨酸phsphatidylserine,PS暴露于细胞外，PS可特异结合标记有异硫氰酸荧光素(fluresEinisthiyanate,FIT)的连接素VannexinV；标记FIT的凋
13、亡细胞在波长为495n紫外光激发下产生525n的绿色荧光，标记PI的凋亡细胞和坏死细胞在波长为340n的紫外光激发下产生620n的红色荧光，经过计算机处理形成DNA二维图.可见AnnexinVFIT染色法不仅可以区分凋亡细胞绿色与坏死细胞红色，而且可检测DNA含量红色，因此AnnexinVFIT染色法是研究细胞凋亡的一种较理想方法.李富荣等11将正常Balb/鼠脾D4+T淋巴细胞用EAg刺激培养16h后，用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(terinaldexynuletidyltranseferaseediateddUTPnikendlabeling,TUNEL)检测其凋亡发
14、生率为0.92%，而小鼠感染泡球蚴12k和25k时凋亡发生率为4.29%和34.72%.本实验结果显示小鼠感染泡球蚴18k时，用AnnexinVFIT染色法检测脾细胞凋亡发生率为16.92%21.35%，类似上述结果，提示泡球蚴感染可诱导小鼠脾细胞发生凋亡，推测泡球蚴抗原经抗原提呈细胞加工处理后，形成1317个氨基酸残基组成的抗原肽，该肽与H分子连接形成抗原肽H分子复合物，经高尔基体运送到AP外表，与小鼠脾细胞TR/D3复合物结合后，诱导胞内Fas/Ap1/D95及其配体FasL表达，导致脾细胞凋亡12，此过程称激活诱导的凋亡ativatininduedelldeath,AID.Kreer等1
15、3证实BG接种可抑制人外周血单核细胞发生凋亡.本文发现BG和空载体皮下注射组小鼠脾细胞凋亡发生率细微低于感染对照组，说明BG免疫对泡球蚴感染鼠脾细胞凋亡具有一定的抑制作用.本实验结果显示皮下注射组和鼻腔内接种组小鼠脾细胞凋亡发生率显著低于感染对照组，提示疫苗接种可抑制泡球蚴感染鼠脾细胞发生凋亡，推测混合重组BGE/3和BGE1433疫苗免疫小鼠后可激活体内的免疫细胞，促进其分泌免疫效应分子，这些免疫细胞与免疫效应分子互相促进和互相调节，抑制泡球蚴感染鼠脾细胞发生凋亡，使小鼠脾细胞数目相对增加，从而加强小鼠抗泡球蚴感染的保护性免疫反响.【参考文献】1AeisenJ,EstaquierJ,Idzi
16、rekT.FrAIDStparasiteinfetin:pathgenediatedsubversinfprgraedelldeathasaehanisfriunedysregulatinJ.IunlRev,1994,142(1):9-51.2TureBaldeASarthuJL,AribtG,etal.PlasdiufaliparuinduesapptsisinhuannnulearellsJ.InfetIun,1996,64(3):744-750.3李文桂,石佑恩.血吸虫重组BGSj26GST疫苗免疫对D4+T细胞凋亡的影响J.中国免疫学杂志,2000,16(专刊):10-13.4李文桂,陈雅棠,刘成伟.双氢青蒿素对卡氏肺
