《聚丙烯酰氨凝胶电泳》由会员分享，可在线阅读，更多相关《聚丙烯酰氨凝胶电泳（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实用标准文案聚丙烯酰氨凝胶电泳目录简介作用补充信息过程常见问题及分析编辑本段 简介聚丙烯酰胺凝胶电泳作用：用于分离蛋白质和寡糖核苷酸。作用原理聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS- 聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE ）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而 SDS-PAGE 仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由 shapiro 于 1967 年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电
2、泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。精彩文档实用标准文案编辑本段 作用SDS 是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS 后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS 结合成蛋白 - SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS-PAGE 一般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔
3、径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL 缓冲液，电极液选TRIS/ 甘氨酸。电泳开始后，HCL 解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。编辑本段
4、补充信息精彩文档实用标准文案聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gelelectrophoresis）聚丙烯酰氨凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（ AP）为催化剂，以四甲基乙二胺 （ TEMED ）为加速剂。在聚合过程中， TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。PAGE 根据其有无浓缩效应，分为连续系统和
5、不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH 值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH ，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、 浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP 催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的 Tris-HCl 。分离胶是由AP 催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2 种孔径的凝胶、2 种缓冲体系、 3 种 pH 值使
6、不连续体系形成了凝胶孔径、pH 值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。编辑本段 过程精彩文档实用标准文案蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967 年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS 和巯基乙醇， SDS 可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质 SDS 复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩
7、盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS 与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质 SDS 复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS 复合物的短轴长度都一样，约为18A ，这样的蛋白质SDS 复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质 SDS 复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。因而SDS 聚丙烯
8、酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。当分子量在15KD 到 200KD 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中： MW 为分子量， X 为迁移率， k、 b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。精彩文档实用标准文案SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS 电泳上应只有一条带， 但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳
9、具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。编辑本段 常见问题及分析1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在 SDS PAGE 不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris HCL 缓冲系统，浓缩胶是pH6.7 ，分离胶 pH8.9 ；而电泳缓冲液使用的Tris 甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下， 泳动效率低； 而 CL 离子却很高， 两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压
10、梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH 的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以， pH 对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。2. 样品如何处理？精彩文档实用标准文案根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS 处理、非还原SDS 处理、带有烷基化作用的还原SDS 处理。1 ）还原 SDS 处理：在上样buffer中加入 SDS 和 DTT （或 Beta 巯
11、基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS 与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer ，离心，沸水煮5min ，再离心加样。2 ）带有烷基化作用的还原SDS 处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH 基团，得到较窄的谱带； 另碘乙酸胺可捕集过量的DTT ，而防止银染时的纹理现象。100ul 样品缓冲液中10ul 20% 的碘乙酸胺，并在室温保温 30min 。3 ）非还原 SDS 处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮 3min ，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为
12、测定分子量来使用。3. SDS-PAGE 电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7 ，分离胶选择pH8.9 ，选择 tris HCL系统， TEMED 与 AP ： AP 提供自由基， TEMED 是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基磺酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。4. 提高 SDS-PAGE 电泳分辨率的途径？精彩文档实用标准文案聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4 度冰箱放置，前者易导致凝固不充分， 后者可导致 SDS 结晶。一般凝胶可在室温下保存4 天，SDS 可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法， 具体可参照郭尧君编著的蛋白质电泳技术手册P82-103 。5. “ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶
