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1、免疫染色实验方法和步骤免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学 (immunol cytochemistry) 等，可以参考如下步骤进行操作。1. 样品准备 (Sample preparation)对于贴壁细胞：可以直接用多孔板，例如 6 孔板、 24 孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。也可以用洁净的盖玻片， 70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到6 孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS 或培养液洗去残留的乙醇。这时就可以种入细胞进行培养，待细
2、胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进 行固定等后续操作。对于悬浮细胞：把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在 载玻片 上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。然后就可以进 行后续操作。如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用 PDL 等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能 力。对于冷冻切片： 切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。对于石蜡切片：脱蜡：切片在二甲苯中脱蜡 5 分钟，再换用新鲜的二甲苯脱蜡，共用二甲苯脱蜡 3 次。无水乙醇 5分钟， 两次。 90%乙醇 5 分钟，两次， 70乙醇 5 分钟，一次。蒸馏水 5 分钟，两次。抗原修复： 根据不同的抗原和抗体， 可以选择把切片放置在如下抗
3、原修复液中， 10mM 柠檬酸钠， pH6.0， 或1mM EDTA , pH8.0，或10mM Tris, pHIO.O , 95C加热12分钟，大约在 30分钟内缓慢冷却至室温。2. 固定可以使用适当的固定液固定细胞或切片，例如碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)。固定完毕后，可以用免疫染色洗涤液(P0106)洗涤两次，每次5分钟。3. 封闭 (Blocking)加入免疫染色封闭液(P0102)，封闭60分钟。如果背景较高，可以4C封闭过夜。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 在整个免疫染色过程中我们推荐使用碧云天的 侧摆摇床 (ESH
4、K02) ，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易 让溶液覆盖样品。如果样品比较容易脱落，也可以把所有的步骤放置在桌面上静止进行，即封闭、抗体孵 育、洗涤等步骤均不需摇动，但静止操作时宜适当延长作用时间或次数。4. 一抗孵育 (Primary antibody incubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液(P0103)稀释一抗。用微型台式真空泵(EVAC06/EVAC07)吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4C在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4C缓慢摇动孵育过夜。回收一抗。加入免疫染色洗涤液， 在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤 5分钟。吸尽洗
5、涤液后，再加入洗涤液， 洗涤 5分钟。共洗涤 3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。5. 二抗孵育 (Secondary antibody inucubation)参考二抗的说明书，按照适当比例用 免疫荧光染色二抗稀释液(P0108)稀释荧光标记的二抗，或者用 免疫 染色(非荧光)二抗稀释液(P0110)稀释辣根过氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或碱性磷酸酯酶(AP)标记的二 抗。辣根过氧化物酶(A0201/A0208/A0216)可向碧云天订购。用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4C在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入免疫染色洗涤
6、液， 在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤 5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液， 洗涤 5分钟。共洗涤 3次。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。6. 蛋白检测 (Detection of proteins) 对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。对于非免疫荧光染色可以选用DAB等适当的显色底物，或 AB检测体系等进行后续检测。7. 多重染色(Multiple staining)如果进行的是免疫荧光染色，通常都可以进行多重染色。对于可以产生有色沉淀物的染色反应，例如DAB染色，一般不适合再进行多重染色。多重荧光染色：可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧光染色。例如
7、用免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Cy3(P0193) 进行红色荧光染色，随后可以用免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC(P0186)进行绿色荧光染色，在完成上述两种染色后可以使用 Hoechst染色试剂盒(C0003)对细胞核进行染色，染色后为蓝色荧光。用HE染色进行复染：免疫荧光染色后可以用 苏木素伊红(HE)染色试剂盒(C0105)进行HE染色。免疫荧光染色步骤Immuno fluoresce nee MethodFroze n Secti onsSnap frozen fresh tissues in liquid nitrogen or isopentane pre-cooled in liq
8、uidn itroge n, embedded in OCT compo und in cryomolds. Store froze n blocks at -80 o C.Cut 4-8 um thick cryostat sect ions and mount on superfrost plus slides or gelat incoated slides. Store slides at -80 o C un til n eeded.Before staining, warm slides at room temperature for 30 minutes and fix in i
9、ce coldacet one for 5 mi nu tes. Air dry for 30 mi nu tes.Wash in PBSParaffi n Secti onsProcedure for Immuno fluoresce nee Stai ning1. Rinse Sections in wash ing buffer for 2x2 min.2. Primary An tibody (没有标记一抗 ):in cubate sect ions in primaryantibody at appropriate dilutionin primary antibody diluti
10、on buffer for 1 hour atroom temperature or overni ght.Note o not rinse sect ions betwee n serum block andprimary an tibody in cubatio n.3. Rinse in washi ng buffer for 3x2 min.4Secon dary An tibody: in cubate sect ions in bioti ny latedsec on dary an tibody(生物素标记的二抗 )(1:500, Vector Labs) in secondar
11、y antibody dilution buffer for30 minutes at room temperature.5. Rinse in washing buffer for 3x2 min.6. Detection: incubate sections in FITC-Avidin D （1:500, Vector Labs） in PBSfor 30 minutes at room temperature. Protecting slides from light starting from this step to the end by covering slides with
12、aluminum foil or black box.7. Rinse in washing buffer for 3x2 min.8. Counterstain with PI or DAPI if desired for 20-30 minutes at room temperature.9. Rinse in washing buffer for 3x2 min.10. Coverslip with Vector aqueous Anti-fade fluorescent mounting medium andseal with nail polish.11. Store slides
13、in dark at 4 oC.石蜡切片免疫组化染色步骤1、载玻片的处理：抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的 ZLI-9001 APES、ZLI-9003 Histogrip 或 ZLI-9005 Poly-L-Lysine 等几种 试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：1.1 APES :现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的 APES中，停留2030秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影
14、响染色结果。1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip 液中，停留12分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60C烤箱烘烤一小时，装盒备用。1.3 Poly-L-Lysine ：将洗净、 干燥的载玻片放入以 1:10 比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中， 浸泡 5 分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。2、常用酶消化：2.1胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%0.1%,消化时间为37C、1040分钟，主要用于细胞内抗原的显示。2.2胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37C、30180分钟
15、，主要用于细胞间质抗原的显示，如： Laminin （层粘蛋白）， Collagen IV （IV 型胶原）等。g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。2.3皂素（Saponin ）:一般使用浓度为 2103、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如 TBS PBS重金属盐溶液等，但实验证明，以 0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果 最好。请选用我公司提供的 ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于 1000ml 的蒸馏 水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的 pH值偏差，请自行调整。3.1石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3% H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟X 3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92C98C之间并持续1015分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必 满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却 1020 分钟（注意：不可将切片从缓冲液 中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。
