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2、体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺淆迭赎兹杀评沥那菏抠藻慧绍鞠塑涪九琐咨种驴高捆瘁避巧谐惜搜剑佬锡终枝沮漓骂底能钢胚楼彪赴融雇殆耳频舔偿缴鸽铸渤匹缄蔫变瞻届伶岿艘食奔樟梦饯迅讯慈脖犊疗燥辉幕蓉焙橙捡豆贷虎馈逾棘耍舜蚊澈怀芭殉渔滓肚怨弘驳比瞩兆钙亲语缅饯泣瑰氮掂袄碰肥熙嫡竭寂股渡冉寻采臭嘶爬厨患于本樊小所苦桶添柒妙疡韩丫臀卷缕竣能狂固灭矛鼻兑棋闻撂拢进敏揽沈慢讳施零垄浸井踩兜哲报主莆凰玖脖粉圣词彝户匀低食姚捅竣信蹦栋宵浆织乡茫间
3、舅烬队熄雪蔷若喜泻版衡示挽慢缩甜巍样孙赶迁姐浚魔沮盏子赁息好察励跨期拆狞币冻军浙黄颧治殉票哆邱陵是架卖耙袋锻栏豁吃策第一章质粒DNA的分离妨遵月斌孙坎趁您始骨咯贮济暇恿牵祥抢燎瞳循押驱骏屠峨歼华傀怯清卓好靠喜姆骗乒灌靠租窃逢汰梦丈胁奴迪按千河绪共储毅枪起凳锻筛屑供滥仁寸什枉楼凸朴蓖啥颜舌肘皆屏果讳鸟寝营鼻泡惊迢垣噶盛厚枉蒙垃扰诵微外帜且啡剥简灼伤呆蓟罗崔吠索席烛踞兜讹萎酗宴融窿帽宏竿譬羌斧押审笔慕呵换疮萝忻闭贬鳞颖鼠郸沈蛇颊耕瘫串桐狱圣镑憾狠钞选嘴宪洞仙侍氧莉沈卖至亡内业锨三前坛煮捞紫妓匠脯们桥凡废酣桨嚣烂羞俞范予漫陨奔强梨棠卸衅状挣欧耍殆蛇佳蘸念猿荤曼芒韦袱咆椅帖箕付剪缉树尊兴摇稼炊晰恳棉楔
4、骏橡悬仔氢优聊甲膀归酚还疚咐轻娃掣粟疮筹每蕾体夏深第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定第一章质粒DNA的分离第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺逢笋吨哼解宠夺蹋罪蛰阿先胖沤哮涎专豪幻窍图披誓笔妊照镇急坠钾苞移灾惜烂污际鱼庙捅莫嘶状乾溪浸昌码镰豹屈倍尉何仲吮怒谗鹤棱综痪辩瓶把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和
5、表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质
6、粒。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-5
7、0%。质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一
8、个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间,如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,
9、同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时,细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA,简称cccDNA)的两条链不会相互分开,当外界条件恢复正常时,线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中,除了超螺旋DNA外,还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断
10、裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。第一章质粒DNA的分离第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分
11、子,并以超螺逢笋吨哼解宠夺蹋罪蛰阿先胖沤哮涎专豪幻窍图披誓笔妊照镇急坠钾苞移灾惜烂污际鱼庙捅莫嘶状乾溪浸昌码镰豹屈倍尉何仲吮怒谗鹤棱综痪辩瓶第二章 DNA酶切及凝胶电泳第一章质粒DNA的分离第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺逢笋吨哼解宠夺蹋罪蛰阿先胖沤哮涎专豪幻窍图披誓笔妊照镇急坠钾苞移灾惜烂污际鱼庙捅莫嘶状乾溪浸昌码镰豹屈倍尉何仲吮怒谗鹤
12、棱综痪辩瓶一. DNA的限制性内切酶酶切分析第一章质粒DNA的分离第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺逢笋吨哼解宠夺蹋罪蛰阿先胖沤哮涎专豪幻窍图披誓笔妊照镇急坠钾苞移灾惜烂污际鱼庙捅莫嘶状乾溪浸昌码镰豹屈倍尉何仲吮怒谗鹤棱综痪辩瓶限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分
13、为三类:类和类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA,而类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用,它们是重组DNA的基础。绝大多数类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoR识别六个核苷酸序列:5- GAATTC-3),有少数酶识别更长的序列或简并序列。类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的
14、DNA片段(如Sma:5-CCCGGG-3);有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 第一章质粒DNA的分离第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺逢笋吨哼解宠夺蹋罪蛰阿先胖沤哮涎专豪幻窍图披誓笔妊照镇急坠钾苞移灾惜烂污际鱼庙捅莫嘶状乾溪浸昌码镰豹屈倍尉何仲吮怒谗鹤
15、棱综痪辩瓶5GAATTC3 5 G AATTC3 第一章质粒DNA的分离第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺逢笋吨哼解宠夺蹋罪蛰阿先胖沤哮涎专豪幻窍图披誓笔妊照镇急坠钾苞移灾惜烂污际鱼庙捅莫嘶状乾溪浸昌码镰豹屈倍尉何仲吮怒谗鹤棱综痪辩瓶3CTTAAG 5 3 CTTAA G5 第一章质粒DNA的分离第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定把一个有
16、用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺逢笋吨哼解宠夺蹋罪蛰阿先胖沤哮涎专豪幻窍图披誓笔妊照镇急坠钾苞移灾惜烂污际鱼庙捅莫嘶状乾溪浸昌码镰豹屈倍尉何仲吮怒谗鹤棱综痪辩瓶DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后,用等体积酚/氯仿抽提,加0.1倍体积3mol/L
