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1、第第2节 微生物的培养技微生物的培养技术及及应用用非细胞型：病毒细胞型细菌真菌微生物原生生物（一）培养基的配置2.分类：1.定义：按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。一、微生物的基本培养技术3.营养组成：水、碳源、氮源、无机盐水、碳源、氮源、无机盐碳源：为微生物提供所需碳元素的营养物质。碳源：为微生物提供所需碳元素的营养物质。如：如：COCO2 2、NaHCONaHCO3 3；石油、牛肉膏、蛋白胨、糖类、脂肪酸等；石油、牛肉膏、蛋白胨、糖类、脂肪酸等氮源：为微生物提供所需氮元素的营养物质。氮源：为微生物提供所需氮元素的营养物质。如：如：N N2 2、NHNH4 4NO
2、NO3 3；尿素、氨基酸、牛肉膏、蛋白胨等；尿素、氨基酸、牛肉膏、蛋白胨等无机盐：除无机盐：除C C、H H、O O、N N元素外微生物所需的其他元素元素外微生物所需的其他元素 如：如：NaClNaCl、KHKH2 2POPO4 4、CaClCaCl2 2、MgSOMgSO4 4等等4.其他条件：pHpH、特殊营养物质、特殊营养物质、O O2 2的需求的需求如：培养乳酸杆菌，需要添加维生素；培养霉菌，需要酸性环境；培养细菌，需要中性或微碱性环境；培养厌氧微生物，需要无氧条件。（一）培养基的配置制制备牛肉膏蛋白牛肉膏蛋白胨固体培养基固体培养基2.称量称量3.溶化4.灭菌5.倒平板1.计算溶药品煮
3、溶琼脂定容调pH培养基、培养皿灭菌冷却到50左右，在酒精灯火焰附近操作根据培养基配方计算配制所需各种成分用量先调先调pHpH。如果灭菌后再调。如果灭菌后再调pHpH，可能造成污染。，可能造成污染。强调1.制备培养基时，溶化完所有药品，应该先灭菌还是先调节pH？2.培养基灭菌后，为什么要冷却到50左右时才倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？温度过高，烫手且易损坏培养皿；温度过低，培养基开始凝固了。温度过高，烫手且易损坏培养皿；温度过低，培养基开始凝固了。用手背估计，以用手背估计，以刚刚不烫手刚刚不烫手为宜。为宜。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既
4、可以防止皿盖上的平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免培养基中水分过快的挥发。水珠落入培养基，又可以避免培养基中水分过快的挥发。1.目的：防止杂菌污染。防止杂菌污染。避免操作者自身被微生物感染。避免操作者自身被微生物感染。（二）无菌技术2.方法：消毒：使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部的 一部分微生物。灭菌：使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。3.主要包括：操作操作空间空间，操作者的，操作者的衣服和手衣服和手进行清洁和进行清洁和消毒消毒 微生物微生物培养器皿，接种用具和培养基培养器皿，接种用具和培养基进
5、行进行灭菌灭菌 应该应该避免避免已灭菌处理的材料用具与周围物品已灭菌处理的材料用具与周围物品接触接触 微生物实验操作微生物实验操作过程过程应该在应该在超净工作台超净工作台并在并在酒精灯火焰附近酒精灯火焰附近进行进行 1.概念：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。（三）微生物的纯培养2.步骤：配置培养基、灭菌、接种、分离和培养等。定义：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见、有一定形态结构的子细胞群体。特征：大小、形状、隆起程度、颜色、边缘形态等。应用：可以作为菌种鉴定菌种鉴定的重要依据。菌落单菌落单菌落酵母菌的酵母菌的纯培养培养1.
6、制备培养基2.接种和分离酵母菌3.培养酵母菌配制培养基、配制培养基、灭菌、倒平板灭菌、倒平板接种后的平板接种后的平板和和未接种的平板未接种的平板倒置倒置，2828左右恒温培养左右恒温培养24-48h24-48h平板划平板划线法法接种环温度过高时就划线，可能杀死平板上的酵母菌。接种环温度过高时就划线，可能杀死平板上的酵母菌。逐步逐步稀释稀释平板上的酵母菌，以期最后能得到单独的菌落。平板上的酵母菌，以期最后能得到单独的菌落。实验目的是要逐步实验目的是要逐步稀释酵母菌稀释酵母菌，若最后划的线与第一区域相连，第，若最后划的线与第一区域相连，第一区域的酵母菌可能转移到最后一区域，导致稀释失败。一区域的酵
7、母菌可能转移到最后一区域，导致稀释失败。1.灼烧接种环后，为什么要等其冷却后再进行划线？2.从第二次划线开始，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？3.为什么最后一区域的划线不能与第一区域相连？注意第一步划线前要灼烧是为第一步划线前要灼烧是为避免避免接种环可能带上接种环可能带上杂菌杂菌，影响对酵母菌的纯化。影响对酵母菌的纯化。之后每次划线前都灼烧，是为之后每次划线前都灼烧，是为保证接种环无菌保证接种环无菌，每次，每次 的划线都是对上一次的稀释。的划线都是对上一次的稀释。操作结束后仍要灼烧，对接种环进行灭菌，以操作结束后仍要灼烧，对接种环进行灭菌，以防微生物防微生物 对环境的污染对环境的污染。4
8、.为什么在操作的第一步以及每次划线前都要灼烧接种环？划线操作结束时，还需要灼烧接种环么？5.如果最终在平板上划出五个区域，整个过程需对接种环进行几次灼烧？6 6次。次。注意二、微生物的选择培养和计数1.概念：概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。（一）选择培养基2.微生物微生物筛选原理：原理：人为提供有利于目的菌生长的条件 （包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长尿素【尿素【CO(NHCO(NH2 2)2 2】含氮量高，是重要氮肥。施入土】含氮量高，是重要氮肥。施入土壤后，会被土壤中的某些细菌（产生壤后，会被土壤中的某些细菌
9、（产生脲酶脲酶催化）分催化）分解成解成NHNH3 3，NHNH3 3再转化为再转化为NONO3 3-、NHNH4 4+等被植物吸收。等被植物吸收。9mL无菌水铲取土样，将样品装入纸袋中将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。稀释涂布平板法的操作过程1mL90mL无菌水1mL1mL1mL1mL1mL（二）微生物的选择培养稀稀释涂布平板法涂布平板法取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培
10、养皿，使涂布均匀。待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，30-37恒温培养1-2天，可观察到单菌落。稀释涂布平板法的操作过程微量微量 移液器移液器稀释要准确稀释要准确；加到培养基表面的菌液应严格加到培养基表面的菌液应严格定量定量；涂布要均匀涂布要均匀，尽可能让菌种分散开；，尽可能让菌种分散开；要有要有重复实验重复实验：同一稀释度应有：同一稀释度应有至少至少3 3组重复组重复，计数时，计数时 取其取其平均值平均值，减少误差。，减少误差。要有要有空白对照空白对照：留一无操作的培养基，与接种的培养基：留一无操作的培养基，与接种的培养基 一同培养。一同培养。注意稀释涂布平板法可以较准确的计算菌液浓度
11、，为了保证结果的准确性，应保证操作的严谨性：（三）微生物的数量测定1.方法：方法：（1 1）稀释涂布平板法：）稀释涂布平板法：一般选择菌落数为一般选择菌落数为30-30030-300的平板进行计数；的平板进行计数；同一稀释度下，至少对同一稀释度下，至少对3 3个平板进行重复计数，然后求平均值。个平板进行重复计数，然后求平均值。统计菌落数比活菌实际数目统计菌落数比活菌实际数目少少：因为当两个或多个细胞连在一起时，因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。平板上观察到的只是一个菌落。（2 2）显微镜直接计数：）显微镜直接计数：利用特定的利用特定的细菌计数板细菌计数板或或血细胞计数板血细胞计数板在显微镜下观察、计数，在显微镜下观察、计数，然后计算。然后计算。统计结果一般比活菌数目统计结果一般比活菌数目大大：统计结果为活菌数和死菌数的总和。统计结果为活菌数和死菌数的总和。每克样品菌株数=（菌落数/液体体积）*稀释倍数微生物纯培养平板划线法稀释涂布平板法显微镜直接计数微生物的数量测定
