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1、应用于废水处理的光合细菌混合培养条件的优化摘要目的研究光合细菌混合培养的最佳条件。方法对沼泽红假单胞菌、荚膜红假单 胞菌和球形红假单胞菌混合培养的环境条件和培养基组分进行了优化试验。结果光合细菌 混合培养的最佳环境条件为：接种量25%，培养基初始pH为7. 0,光照度为5 000 lx,温度为30 C ;培养基最佳碳氮比为4：1。结论为光合细菌的产业化应用提供了指 导。关键词光合细菌；混合培养；培养条件；生长曲线Optimization of Cultural Conditions for Mixed Photosynthetic Bacteria Used for Wastewater Tr
2、eatmentAbstract Objective The aim was to obtain the optimum cultural conditions for mixed photosynthetic bacteria. Method Optimized test wascarried out under the environment and medium components on the multiplication of mixed photosynthetic bacteria ( Rhodopseudomonas palus-tris, Rhodopseudomonas c
3、apsulate and Rhodopseudomonas spheroides) . Result The results showed that the optimum conditions were 25% inoculums density, 7. 0initial pH, 5 000 lx illumination intensity and 30 C temperature. The optimum ratio of C / N was 4：1.Conclusion Itwould provide guidances for industrialized application o
4、f photosynthetic bacteria.Key words Photosynthetic bacteria; Mixed culture; Culture condition; Growth curve光合细菌(Photosynthetic Bacteria, PSB)是地球上最早出 现的具有原始光能合成体系的原核生物，是一大类水生的， 能够在厌氧光照、好氧光照、好氧黑暗等条件下进行不放氧 光合成代谢的细菌类群的总称1。根据伯杰细菌鉴定手册(第八版)，PSB可分为紫色细菌和绿色硫细菌，尤其是红螺菌科(Rhodospirillaceae)的细菌具有丰富的代谢多样性，能根据外界条件的变
5、化改变自身的代谢方式。因此，PSB在染 料、芳香化合物等有机废水的处理中得到广泛的应用2 -4O然而，由于纯菌株在培养过程中环境适应性较低，易受杂菌 污染，PSB纯培养物在应用过程中的作用效率大大低于实验 室5，因而，不少学者试图通过微生物的混合培养，以提高其环境适应性。目前，关于PSB混合培养方面的研究6较少。为此，笔 者以沼泽红假单胞菌、荚膜红假单胞菌和球形红假单胞菌为 研究对象，综合考察了培养环境条件和培养基组分对PSB混 合培养生长的影响，以期为PSB的大规模培养及其在废水处 理中的应用提供技术资料和菌种资源。1材料与方法1. 1试验材料1. 1. 1菌株。PSB菌株：沼泽红假单胞菌(
6、Rhodopseudo- monas palustris)、荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonas capsula- ta)和球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)，保存于 浙江工商大学。1.1. 2培养基。基础培养基：CHCOONa 1. 4 g， NaCl 1. 0 g，NH4Cl 0. 6 g， MgSO40. 2 g，CaCl 20. 05 g， KH2PO40. 6 g，K2HPO41. 5 g， FeSO40. 01 g，微量元素MnSO42. 0 mg，Cu( NO3)2 0. 2 mg，Zn( NO3)20. 25 mg，Na 2Mo
7、O40. 7 mg,H3BO32. 0 mg，谷氨酸0. 2 mg,生物素0. 15 mg，蒸馏水1 L, pH 7. 0。1. 1. 3试验仪器。主要仪器：光照培养箱LRH-250-G;紫外 分光光度计JASCO V-550;酸度计PHS-25;电子天平；实验室 常用玻璃仪器等。1. 2试验方法1. 2. 1 PSB混合种子液准备。将实验室保存的沼泽红假单 胞菌、荚膜红假单胞菌和球形红假单胞菌活化培养并分别稀 释平板计数，然后，将沼泽红假单胞菌、荚膜红假单胞菌和球 形红假单胞菌按菌落数1：1：1进行混合，即为PSB混合种 子液。1. 2. 2 PSB混合培养环境条件优化。将PSB混合种子液接
8、 种于一定量基础培养基的锥形烧瓶中，光照培养7 d;进行接 种量（10%、20%、25%、30%、40%）、培养基初始 pH（ 6、7、8、 9、10）、光照强度（2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 lx）及培养 温度（25、30、35. 40 C）优化试验，每隔1 d取样测量菌悬液 浓度。1. 2. 3 PSB混合培养基组分优化。碳源和氮源的量（即碳 氮比）是影响细菌大量增殖的重要因素。在上述获得的最佳 培养条件下，将PSB混合种子液接种于一定量基础培养基的 锥形烧瓶中，光照培养7d，进行碳源（0.6、1.2、1.8、2.4、3.0g /L）和氮源（0. 3、0. 6
9、、0. 9、1. 2、1. 5 g /L）优化试验，每隔 1 d 取样测量菌悬液浓度。1. 3分析方法1. 3. 1混合PSB生长的测定。采用分光光度计法，测定 PSB菌悬液在550 nm处的吸光度值。1. 3. 2数据处理。采用Microsoft Excel 2003软件处理，所 用数据均为3次测定的平均值。2结果与分析2. 1接种量对PSB混合培养的影响将初始OD 550=2. 8的混合 PSB 种子液按 10%、20%、25%、30%、40% （ V/V）接 种量接种于一定量基础培养基的锥形瓶中，在光照培养箱中 培养7 d，每24 h取样测定生长情况。结果表明（图1），随着 接种量的增加
10、，培养至稳定期菌体量逐渐增加，然而，当接种 量大于30%，培养1 d后PSB生长速率明显变慢。另外，考 虑到接种量大必然会增加大规模培养的成本，因此选择培养 PSB适宜的接种量为25%左右。安徽农业科学，Journal of Anhui Agri Sci. 2011, 39（ 15） :9151 9153 责任编辑 罗 芸责任校对李岩图1接种量对PSB生长的影响Fig.1 The influence of the inoculums on the growth of PSB2. 2初始pH对PSB混合培养的影响将初始OD 5502. 8的混合PSB种子液按25%的接种量接种于一定量基础培 养基
11、的锥形瓶中，分别调节培养基初始pH为6、7、8、9、10,在 光照培养箱中培养7 d,每24 h取样测定生长情况。结果表明（图2），当培养基初始pH610时，PSB均能生长，说明混合PSB有较强的环境适应性，当pH为7. 0时，PSB的生长情况最好，菌体量最大。当pH为6. 0时，PSB在第1天内处于生长停滞期，而后进入对数期，这可能是PSB不适宜在弱酸性环境下生长，但在PSB代谢过程中会释放出碱性物质，使 培养液pH重新升高的缘故7O图2初始pH对PSB生长的影响Fig. 2 The influence of initial pH on the growth of PSB2. 3光照强度对P
12、SB混合培养的影响将初始OD 5502. 8的混合PSB种子液按25%的接种量接种于一定量基础培养基的锥形瓶中，培养基初始pH为7. 0，分别设置光照度为2 000、3 000、4 000、5 000和6 000 lx，在光照培养箱中培养7d，每24 h取样测定生长情况。结果显示（图3），光照强度越大，PSB生长越快，当光照强度为5 000 lx时，PSB生长稳定，3 d后培养成熟，菌悬液颜色为深红色，培养好的菌液能够保持较高的活性；当光照强度为6 000 lx时，PSB生长也较为迅速，但菌体易老化。因此，混合PSB生长的适宜光照强度为 5 000 lxo2. 4温度对PSB混合培养的影响将初
13、始OD 550=2. 8 的混合PSB种子液按25%的接种量接种于一定量基础培养基的锥形瓶中，培养基初始pH为7. 0，光照度为5 000 lx，温度分别设置为25、30、35. 40 C，培养7 d，每24 h取样测定生长情况。结果显示（图4），PSB在2540 C的温度范围内均能 图3光照强度对PSB生长的影响Fig. 3 The influence of illumination intensity on the growth of PSB 生长，但温度过高或过低都不利于PSB的生长。温度过高可 能会导致蛋白质或核酸的变性失活，进入对数期的时间延 长；温度过低，细胞活性不足，菌体量相对较
14、少；但高温对菌体生长的影响较为明显。在温度为3035 C时，PSB生长状况良好，故在大规模培养中可以选择30。作为培养温度， 并且3 d后就能终止培养，用于废水处理等。图4温度对PSB生长的影响Fig. 4 The influence of different temperatures on the growth of PSB2. 5培养基碳氮比的优化在最佳环境条件下将初始OD550=3. 8的混合PSB种子液接种于一定量基础培养基的锥形瓶中，光照培养7 d,碳源含量分别为0. 6、1. 2、1. 8、2. 4 和3. 0 g/L，得出较优碳源添加量，在最佳碳源条件下再进行氮源（0. 3、0.
15、 6、0. 9、1. 2、1. 5 g/L）优化试验，从而得出最佳碳 氮比。结果表明（图5），当醋酸钠添加量过低时，PSB生长缓 慢，对数期不明显，菌体量也较少；而当醋酸钠浓度为3. 0 g /L时，PSB生长迅速，对数期较长，但4 d后迅速进入老化衰 退期。综合考虑，当醋酸钠浓度为2. 4 g/L时，PSB生长良好 且稳定，故选择其作为最优碳源添加量。由图6可知，当氮 源浓度较低时，菌体量不足，而当氮源浓度较高时，菌体的生 长又会受到一定的抑制作用，故得出最佳氮源添加浓度为 0. 6 g /L，从而确定培养基的最佳碳氮比为4：1。2. 6最佳培养条件下PSB生长曲线在上述最佳条件 下，对PSB混合培养进行跟踪测试，观测其OD 550值，并绘制生长曲线。结果表明（图7），经过12 h的生长停滞期，PSB 进入快速增殖的对数期，3 d后基本进入生长平稳期，菌体能 保持较长时间的活性，而一般来说，生长对数期的菌体细胞 活性最高，此时细胞需要消耗大量营养物质用于生长繁殖，9 152安徽农业科学2011年图5碳源量对PSB生长的影响Fig. 5 The influence of carbon concen
