《紫杉醇产量影响因素》由会员分享，可在线阅读，更多相关《紫杉醇产量影响因素（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、影响紫杉醇生产的因素和提高产量的方法摘 要 综述红豆杉细胞培养，内生真菌培养等方法生产紫杉醇的影响产量的各种因素。并 且列举一些提高产量的方法。关键词 紫杉醇；生产；产量；方法 紫杉醇是一种高效的抗癌药物，它能与微观蛋白结合，促进其聚合，抑制癌细胞的有丝 分裂，阻止癌细胞的无限增殖。目前，人们获得紫杉醇的途径主要有：红豆杉中提取，细胞 培养，微生物发酵，化学合成等。而红豆杉中紫杉醇含量非常低，加之该属植物生长极其缓 慢，因而目前多研究后几种方法生产紫杉醇。1 红豆杉细胞培养利用红豆杉细胞培养能够连续均匀生产，外界条件影响不大，而且可以在生物反应器中 大规模培养，易于提高产量和进行产物的分离提取
2、纯化，是目前工业化生产的首选方法。 1.1 外植体的选择茎段比离体叶片更易诱导出愈伤组织，带叶茎段外植体比不带叶茎段外植体形成愈伤组 织要早些，诱导率也稍高;以树皮作为外植体诱导效果不佳。红豆杉树的品种对外植体愈伤 组织的诱导率和诱导速度也有影响。以云南红豆衫的诱导率最高，诱导速度也最快，相对而 言东北红豆衫较差。外植体采样季节对愈伤组织的诱导有影响。云南红豆杉早春取样的茎段 形成愈伤组织的时间要比秋季取样早得多，春、夏季取样的东北红豆衫茎段形成愈伤组织的 时间、比率均高于秋季取样，而且形成的愈伤组织颜色较浅.同以紫杉醉含量高的外植体作 为诱导材料，可获得紫杉醉产量高的细胞系。云南红豆衫和中国
3、红豆杉愈伤组织中紫衫醉含 量较高，是获得紫衫醉高产愈伤组织系的外植体的较佳来源。1.2 培养基1.2.1 种类外植体的愈伤组织诱导率与培养基种类有关。在MS培养基上，东北红豆衫幼叶的诱导 率最高，而在 BS 培养基上，幼茎的诱导率最高。 11.2.2 N 源培养基中氮源影响红豆杉愈伤组织的生长和紫杉醉的含量。培养基中NO3-浓度高有利 于红豆杉愈伤组织的生长而NH4+浓度高则抑制愈伤组织的生长，但可提高紫衫醉的含量。1.2.3 pH培养基的pH值是影响红豆杉愈伤组织生长及紫杉醇含量的重要因素。对东北红豆衫而 言，较高pH值对生长有利，pH值为7.0时愈伤组织生长状态最好，但pH值为6.0时愈伤
4、 组织中紫衫醉的含量最高;对南方红豆杉而言，pH值为5.5时对愈伤组织的生长最为有利， pH值为7.0时紫衫醇的含量最高。可见，有利于愈伤组织生长的pH值不同于次生代谢产物 合成所需的适宜pH值。紫衫醉的产量取决于生物盘的增加和其中紫衫醉的含量两方面的因 素.因此，用细胞培养法生产紫杉醉时需综合考虑愈伤组织生长和紫衫醉形成对各种培养条 件的不同要求。1.2.4 前体饲喂前体饲喂细胞一方面可以通过增加第五两来加快反应速度和提高产率，另一方面还能够 反馈抑制分支路径而促进反应顺利进行，有效提高紫杉醇产量。苯丙氨酸，苯甲酸，苯甲酰 甘氨酸，甘氨酸，丝氨酸等多种前体，无论在愈伤组织培养还是悬浮培养中均
5、能显著促进紫 杉醇的合成。苯甲酸可结合到紫杉醇的侧链上，亦或提供苯甲酰基团，促使C-13侧链上的 苯基异丝氨酸发生酰化反应。甘氨酸，丝氨酸能够进入忙草酸途径，从而促进苯丙氨酸，苯 甲酸的合唱，苯甲酰甘氨酸也可水解为苯甲酰和甘氨酸2部分，从而间接促进紫杉醇的合成。 香叶醇对细胞的生长影响不大，但能够使紫杉醇的含量和产量大幅度提高。1.2.5 添加抑制剂：在中国红豆杉悬浮培养细胞添加单菇合成抑制剂,aid烯，松油醇，樟脑.除松油醇外，a 烯、樟脑a烯+松油醇以及a烯+松油醇+樟脑对红豆杉细胞生长有较大影响，但对紫杉醇的 生物合成都有促进作用.二者同时添加将全面阻止能量和物流过多流向单菇 3 个旁路
6、途径， 使更多的能量和物流集中到由单菇合成一菇的途径中来，从而提高了紫杉醇的产量.1.2.6 添加诱导子紫杉醇是一种植物防卫素，可以被诱导子所诱导。生物诱导子：茉莉酸甲酯作为细胞信号转导系统中的一种重要物质，广泛参与了植物防御信号的转导 与放大过程.在不同培养时间加入不同浓度的茉莉酸甲酯，均能促进紫杉醇合成，只是增加 量略有不同。茉莉酸甲酯的加入时间和浓度与紫杉醇产量有明显相关性，茉莉酸甲醋在对数 生长期初期至稳定期之前加入且浓度为100 umol/ L 时，诱导作用显著。花生四烯酸的诱导 效果也较好，浓度为5 ug/g时即可将紫杉醇含量提高9. 3倍。且茉莉酸甲酯与花生四烯酸有 明显的诱导协
7、同作用。水杨酸(SA )是存在于植物体内的重要的酚类物质，与植物抗病性密 切相关。SA介导的信号传递途径与植物抗病性关系受到广泛关注。它作为一种重要的细胞 信使与植物抗毒素，可以诱导呼吸方式从细胞色素呼吸途径到交替呼吸途径的转变，为植物 病理反应提供物质、能量以及信号传导的基础。 20mg/L 水杨酸对紫杉醇促进效果最明显， 紫杉醇含量可提高 10 倍以上。 2 非生物诱导子：非生物诱导子包括化学伤害胁迫(重金属盐类、去污剂、乙烯、氯仿、杀真菌剂等)和物 理伤害胁迫(紫外线、辐射、冻融等)。一些重金属也可作为促进细胞合成与释放紫杉醇的诱 导子。镧，铈能不同程度地提高细胞中紫杉醇的合成与释放，其
8、中以正二价的铈离子效果最 显著。平稳期加入稀土有利于生物量的积累，但对每升发酵液中紫杉醇总量而言，对数期加 入稀土化合物效果更好。在指数生长期末红豆杉培养细胞对Cu+诱导处理具有最强的反应 能力培养基中添加浓度在0.5lOOumol/ L之间的CuCl2，均能诱导紫杉醇的合成。硫酸钒 酞的加入可以显著促进细胞中紫杉醇的形成其中以10 mg/ L处理效果最好。1.2.7 植物生长调节因子在培养液中添加不同种类和浓度的生长激素对悬浮细胞的生长和紫杉醇的产量都有一 定的影响。NAA和BA的配比对愈伤组织生长及生产紫杉醇的影响表明随着BA浓度的增加，愈 伤组织的生物量呈现下降趋势，相比之下， NAA
9、对愈伤组织的影响较小。综合考虑紫杉醇 的总产量，NAA和BA的浓度各为1 mg/ L的配比为最佳激素比例。低浓度的2, 4-D(0. 51. 0 mg/ L)比较适合于紫杉醇的合成，而较高浓度的2,4刁(1.0 2. 5 mg/ L)则比较适合于细胞 的生长综合2方面的因素，较佳的2, 4-D浓度为1. 05mg/ L。使用IAA比2, 4-D更能有效 地提高紫杉醇的产量，而使用NAA时紫杉醇的产量变化与使用2, 4-D的结果相差不大。当 细胞分裂素与生长素联合使用于细胞b.浮培养时则具有更好刺激生长的效果对紫杉醇生产 而言，IA A与BA结合使用是最好的组合，紫杉醇的产量可达14. 78 士
10、 0. 86 mg/ L。此外， 2, 4-D或IBA与BA的组合也能有效地提高紫杉醇产量.为了达到高产量紫杉醇的日的，适 当地调整生长素与分裂素的比例至关重要.适度的2, 4-D和KT比例可以改善细胞生长状态 和提高紫杉醇产量。1.3生物反应器目前主要的生物反应器类型有:机械搅拌生物反应器，气升式反应器，流化床反应器， 以及膜反应器。但是目前这一类反应器都是在参照微生物发酵技术方面发展起来的。真正适 用于培养植物细胞生产次生代谢产物特别是紫杉醇能达到工业化生产的生物反应器还没有 由 S.H.Son 等研制的一种综合气升式和流化床反应器特点的发泡生物反应器在培养红豆杉 胚源细胞株时，发现在20
11、 L 小规模培养反应器中培养的基础在100-500 L 反应器中的培养 情况具有良好的重现性，能够大幅提高紫杉醇的产量，在培养27 d后获得大约3 mg/L的紫 杉醇和74 mg/L的总紫杉烷类物质。31.4 其他因素温度对红豆杉细胞的生长与紫杉醇的合成都有显著影响.细胞的最佳生长温度是24 C, 而在29C培养对紫杉醇的合成最有利。可以采取悬浮细胞先在24C培养21 d,然后升温到 29C培养积累代谢产物。4光照条件也是影响细胞生长和紫杉醇产量的重要因素。红豆杉 的悬浮细胞适于在较黑暗的条件下生长。在黑暗条件下细胞生长速度较快，约为光照条件下 细胞生长速度的 3 倍，紫杉醇的产量也是光照条件
12、下细胞紫杉醇含量的3 倍。超声处理可以 提高红豆杉细胞紫杉醇的总产量和胞外释放百分率。 5气体组合也会较大地影响紫杉醇的 含量.根据紫杉醇的产量，最为有效的气体混合组成是10%(体积分数)氧气， 0. 5%(体积分数) 一氧化碳和 5*e-6 乙烯。2 真菌培养紫杉醇产生菌卞要是一些红豆杉的内生真菌.真菌中最高紫杉醇含量为 185. 4ug/L ,可 见，当前利用微生物发酵方法产生紫杉醇的量很低，难以达到工业化生产的要求.而目，真 菌自身合成紫杉醇的途径还未见报道，自身是否存在紫杉醇的合成途径还需进一步研究探索. 此生产方法的前景还不明朗.3 化学合成法紫杉醇结构复杂，母核有9 个乎性中心，因
13、此应有2048个非对映异构体。采用全合成 方法不仅步骤多而且由于众多异构体，分离提纯困难，难以得到高纯度紫杉醇。采用化学半 合成方法，受到以下几个因素影响：一是合成原料在植物中含量不高，提取分离成本较高 二是每一步反应得率低，而目有时会碰到选择性较差的问题.所以，无论是全合成还是半合 成，都难以应用于大规模的工业化生产。 64 提高紫杉醇产量方法4.1 筛选高产细胞株系利用基因工程技术提高紫杉醇含量取决于两个条件:红显杉遗传转化和植株再生体系的 建立及红显杉中与紫杉醇生物合成相关基因的克隆。 7紫杉醇的生物合成过程已基本阐明:二甲基丙烯基焦磷酸合成香叶基香叶基焦磷酸，通 过紫杉二烯合成酶，后者
14、合成紫杉-4(20)， 11(12)-二烯，通过 P450 单加氧酶催化，生成紫杉 -4(20), 11(12)-二烯-5a-醇，在紫杉二烯-5a-醇-O-乙酞转移酶作用下，合成乙酸紫杉一4(20),11(12)-二烯-5a-酯，再生成10-去乙酞巴卡亭III，再在10-去乙酞巴卡亭III-10-0-乙酞 转移酶催化下生成巴卡亭III,巴卡亭III在巴卡亭III -13-0-苯基异丝氨酸转移酶作用下和苯 基异丝氨酸生成去苯甲酞紫杉醇，去苯甲酞紫杉醇在去苯甲酞紫杉醸N 苯甲酞转移酶作 用下最后生成紫杉醇。在紫杉醇的合成代谢中有几类重要的与合成速度有关的限制酶:紫杉 二烯合成酶和细胞色素P450单
15、加氧酶。这些酶催化的反应都可以作为利用基因工程方法提 高紫杉醇产量的重要靶点。通常用分离和克隆的关键酶的基因加上强的启动子或者经过修饰后，构建在质粒载体 上，通过根癌农杆菌转化到红豆杉基因组中，构建转基因模式红豆杉植株或者紫杉醇高产细 胞系。或者是通过发根农杆菌转化红豆杉枝叶或愈伤组织得到毛状根或冠癭组织，用毛状根 系统和冠癭组织来生产紫杉醇。 84.2 内生真菌发酵4.2.1 菌种改良诱变：常规诱变改良菌种，利用紫外线， EMS， Co， NTG 等诱变剂。而后，采用原生 质体诱变及原生质体融合技术也能大幅度提高内生真菌紫杉醇含量。 9基因工程：一是将从红豆杉树中分离到的紫杉醇生物合成过程中
16、的限速酶的基因转入到 紫杉醇产生菌体内，提高关键酶的表达量.进而提高紫杉醇的合成能力。二是从产紫杉醇的 内生真菌细胞中分离出产紫杉醇的关键酶基因并将其导入微生物体内，利用其它真菌甚至细 菌、酵母菌构建新的紫杉醇高产上程菌株来生产紫杉醇。4.2.2 优化培养基及发酵条件 通过添加碳源、氮源和前体物、特殊的诱导子、抑制剂等物质借助代谢途径上程的研究来提高真菌紫杉醇的合成量。 105 结语迄今为止，虽然在实验室中已对紫杉醇的生产做了很多工作，但离工业化大规模生产还有相 当大的距离，主要原因在于缺乏关于紫杉醇生产的基础研究，如生物合成途径、关键酶调控 等等了解不够。因此，今后要进一步探讨影响紫杉醇生物合成的因子，特别是要加强对紫杉 醇的生物合成途径的研究，促使这一药用植物资源的研究与开发早日实现工业化大规模生 产，造福广大癌症患者。参考文献
