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1、基因工程是通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细 胞，通过复制，转录，翻译外援目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗 传性状的操作。基因工程的目标是实现转基因生物性状的定向改良，技术上包括基因或DNA 的体外重组，转基因，重组子筛选与扩大繁育等多个环节，目的性和技术性都很强，需要严 密的实验设计。基因工程的技术流程包括以下几个基本环节：目的基因克隆，载体的准备， 目的基因与载体的连接，重组DNA转化/转染/转导，重组体的筛选与鉴定，最后是重组体 的大量培养，外源基因表达效应分析与开发应用。从技术流程来看，基因工程包括四个基本 条件：目的基因，载体，工具
2、酶以及宿主细胞。基因工程的发展经历了理论和技术的酝酿，诞生和快速发展等几个阶段。遗传物质DNA 的确定，DNA双螺旋结构的提出以及半保留复制机制的届是以及中心法则的提出为基因工 程的诞生奠定了理论基础，而限制性内切酶核酸，连接酶的发现，载体的应用以及大肠杆菌 转化体系的建立则为基因工程的诞生奠定了重要的技术基础。基因工程能够真正应用离不开酶学，DNA重组技术的建立和发展是以各种核酸酶的发 现和应用为基础的，特别是限制性内切核酸酶和DNA连接酶的发现和应用，使DNA分子 的体外切割与连接真正成为可能。通过切割相邻两个核苷酸残疾之间的磷酸二酯键，从而使 核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶叫做核酸酶
3、，把应用于基因工程的各种核酸酶统称为 基因工程的工具酶。基因工程中常用的工具酶有邛艮制性内切核酸酶（特异切割DNA）, DNA连接酶（DNA 片段间连接，产生重组DNA分子），DNA聚合酶丨（切口平移制作高比活探针；3突出末端 DNA分子标记），Klenow片段（3凹陷末端的补平；双链DNA 3末端标记；延伸寡核苷酸 引物合成探针），TaqDNA聚合酶（PCR）,反转录酶（合成cDNA）,碱性磷酸酶（去磷酸 化，防止载体自身连接），RNA酶（去除基因中的RNA）。限制性内切核酸酶（restriction endonuclease），简称限制酶，是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序
4、列，并切割DNA双链结构的内切核酸酶。已经鉴定出的限制性 内切核酸酶可以分为四种不同的类型:Type I, Type H, Typelll, TypelVll型限制性内切 核酸酶只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在，因为其识别和切割DNA分子具有严格的 特异性，所以是基因工程中广泛使用的工具酶，被誉为基因克隆的“分子剪刀”。限制性核酸 内切酶的活性受到以下几方面的影响：酶的纯度；DNA样品的纯度；DNA的甲基化程度； 酶切反应的温度；DNA分子的构型；反应缓冲液；酶的星号活性；位点优势效应；末端切 割。DNA连接酶（DNA ligase）是能催化双链DNA片段靠在一起的3羟基末端与5段磷 酸基
5、团末端之间通过形成磷酸二酯键,使两末端连接的一种核酸酶。目前发现和利用的DNA 连接酶主要来源于大肠杆菌，T4噬菌体和耐热细菌。在连接反应中，首先ATP （有些连接 酶是NAD + ）与DNA连接酶反应，与连接酶生成一种共价结合的酶-AMP复合物，AMP激 活DNA-条链的5末端磷酸基团并转移到磷酸基团上，形成DNA-腺苷一磷酸复合物，最 后3-OH对激活的磷原子进行亲核攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。其作用特点 是：连接反应是耗能过程；不能够连接单链DNA分子；只能连接缺口不能连接裂口。影响 连接反应的因素有：反应温度；连接酶浓度；ATP浓度；DNA片段末端。基因工程的诞生，标志着人类打破历经数十亿年所形成的自然界固有的秩序，可跨物种 进行基因交流，从源头上对生命进行控制或修饰，是人类从认识生命，探索生命奥秘的必然 王国进入到改造生命的自由王国。基因工程对自然界和人类社会生活的影响之广，之深，是 任何其他技术所无法比拟的。
