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1、方法题吸光度范围误差来源操作MTT法0-0.7MTT还原产物（甲瓒）需被DMSO 充分溶解；96孔板靠近边缘的两 轮易挥发，测定时间超过24h即 舍去这两轮数据（可保证培养箱 中一定的湿度）MTT过滤除菌、 避光、不可反复 冻融，致癌SRB法1.5-2.0非缓冲Tris-base碱液溶解与细胞 蛋白结合的染料应迅速，避免动 作过慢造成与细胞蛋白结合的染 料解吸附不容易变色，操 作繁琐MTT 法又称 MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉 积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚
2、砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫 检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内， MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗 肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 MTT 法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结 果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT吸光度最好在0-0.7范围内。由于MTT经还原 所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结 果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者
3、也有损害。配制方法通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲 液（PBS）或无酚红的培养基中，用022m m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4C避光保 存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。配制MTT时用PBS溶解,也有人 用生理盐水配，60C水浴助溶。PBS 配方：Nacl 8g Kcl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g 调 pH 7.4 定容 1L注意事项 MTT 一般最好现用现配，过滤后4C避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保 存在-20C长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光
4、袋或是黑纸、锡箔纸包住避 光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必 要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候 小心,有条件最好带那种透明的薄膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔 板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者可以把操作台上的照明灯关掉.做 MTT 测定中,觉得最容易引起误差的一个问题, 是 96 孔板里溶液在培养过程中容易挥发, 特别是靠近边缘的两轮,在测定时间超过24 小时的情况下, 存在明显的挥发现象, 测定数据 与中心孔有较大的出入. 所以做的时候要求培养箱里的湿度条件控
5、制的比较好, 要不就需要 弃取周围两轮孔的数据. 另外,有些时候在需要加入不溶性颗粒状药物的情况下测定细胞的 增殖情况,MTT法就比传统计数法或台盼蓝法效果好，测定速度快，不容易引起误计.MTT的方法不够敏感，而且如果不是贴壁细胞的话，在离心后去除培养基是容易丢失细胞, 造成孔间平行度比较差。 3H-TdR 的敏感度非常好，但是重复性不是特别好，孔间差距比较 大，而且不同时间的重复试验时CPM值可以相差比较大。可以通过寻找比较好的细胞浓度， 确定掺入时机（细胞处于对数生长期）和掺入时间来弥补。贴壁细胞1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度 至1000-1
6、0000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。2、5%CO2, 37C孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物原则上， 细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药. 一般5-7个梯度海孔100ul,设3-5个复孔建议设5个，否则难以反应真实情况3、5%CO2, 37C孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT）,继续培养4h。若药物与MTT能够反应， 可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。另有说法强调 加MTT时用无血清培养液（! MSC1X105,1
7、00ul接种96孔板 2测前4力，更换无血清培 养液，同时加入20ul/U MTT液（5 mg/ml），37 0c，5%co2, 4h 3吸取上清，加入150 ul DMSO，震荡15 min 4 370c，5%co2, 4h （此时间应根据具体的颜色反映来定）5490 nm 测 OD 值，）5、终止培养，小心吸去孔内培养液。6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免 疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介 质、培养液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞1、收集对数期
8、细胞，调节细胞悬液浓度1x106/ml，按次序将补足的1640 （无 血清）培养基40ul ；加Actinomycin D （有毒性）10ul用培养液稀释l g/ml，需预试寻找 最佳稀释度，1:10-1:20）；需检测物10ul；细胞悬液50ul （即5x104cell/孔），共100ul 加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加 储存液100 1640）。2、置37C，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察o1OO0（3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT）,继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用 WST-1,培养4 h后可跳过步骤4），直接酶
9、联免疫检测仪OD570nm （630nm校准）测量各孔 的吸光值）4、离心（1000转x10min）,小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振 荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm （630nm校准）测量各孔的吸 光值15、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介 质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔（1）SRB检测方法：磺酰罗丹明B（Sulforhodamine B，SRB）比色法，是一种检测细胞增殖情 况的方法1（2）SRB 检测方法的原理： SRB 是一种粉红色阴离子染料，易溶于水，在酸性
10、条件下可特 异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合；在540 nm波长下产生吸收峰，吸光值与细 胞量成线性正相关，故可用作细胞数的定量检测。SRB染色后不会像MTT法那样很容易变 色，细胞固定染色后在96孔板中可以放置较长时间，因而受测定时间的影响较小。用Tris-base 溶液溶解的SRB也可稳定较长时间。因此不同时间点固定的96孔细胞培养板可在同一时间 测定，测定的吸光值结果不会受到明显影响。吸光值与SRB浓度作图时，在OD单位1.5 2.0以下为线性,当超出线形范围时，最好稀释后重新读数。虽然SRB法比其他检测方法操 作步骤繁琐，但是由于时间可以自己掌握，不受限制，因此适用于高通量筛选
11、1（3）SRB 检测的操作步骤：1）细胞固定：药物作用时间终点时，每孔加入50p L4C预冷的TCA溶液（30%, w/v）固定细胞， TCA溶液的终浓度为10%。静置5 min移入4C冰箱中固定1 h,取出用去离子水冲洗5遍， 室温晾干12）染色：待96孔板室温下晾干后，每孔加入0.4%（w/v）的SRB染液（1%的乙酸配制）70p L,染 色30 min后倒掉染液，用1%（v/v）乙酸冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干。3)检测：用100mL非缓冲Tris-base碱液(10mM, pH=10.5)溶解与细胞蛋白结合的染料，水平 摇床上振荡20min,采用酶标仪540nm处测定光吸收值。
12、操作中，应注意洗除染料时操作 需迅速，避免用移液器吸取液体，防止动作过慢造成与细胞蛋白结合的染料解吸附。(4)SRB 检测的计算公式根据美国国立癌症研究所(National Cancer Institute， NCI)关于SRB检测的介绍，细胞增殖百 分率的计算存在以下两种情况：1)Tx-T00，PG=100x(Tx-T0)/(C-T0) ； 2)Tx-T00，PG=100x(Tx-T0)/T0。其中，T0：药物作用前的细胞经过固定、染色后测得平均吸光值；C： 培养基中加有等体积的DMSO,没有药物作用的阴性对照的平均吸光值(阴性对照)；Tx： 药物作用终点时细胞经过固定、染色后测得平均吸光值。PG即Percentage Growth，是指药 物作用的样品孔与阴性对照孔中细胞增殖量的百分率。
