消化道酶活力

《消化道酶活力》由会员分享，可在线阅读，更多相关《消化道酶活力（18页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、第四章 牛蛙主要消化酶的分布及 pH 和温度 对消 化酶活力的影响牛蛙（Rana catesbeinanO隶属两栖纲无尾目蛙科，其肉质细嫩，味道鲜美，营养 丰富，是有名的肉用型蛙类。牛蛙具繁殖快、适应性强、生长迅速和抗 逆性强等优点， 且其养殖饲料易取。在我国，牛蛙的人工养殖得到了大规模 1推广 。研究消化酶的活力及其影响因素可了解动物对食物不同成分的消化 能力，为动物天 然饲料的选择、优质人工饲料的配制和适宜养殖条件的确 立提供理论基础，对提高动物 养殖的经济效益无疑是有帮助的。目前，对 低等脊椎动物消化酶的研究主要集中在经济 养殖型鱼类2-9 和爬行类 10 ，对两栖类消化酶的研究报道较少

2、 11-14 。奚刚等14对牛蛙幼体发育阶段消化道 蛋白酶和淀 粉酶的活力变化情况进行了研究。有关成体牛蛙消化系统消化 酶分布情况及各种理化因 子对牛蛙消化酶活力的影响方面的研究尚未见报道。pH和温度是影响牛蛙生活的重要环 境因子，其可通过影响消化酶活力直接影响牛蛙对食物的消化吸收能力，并最终影响牛蛙的生长发育。本 文在检测牛蛙 消化系统蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶分布情况的基础上，对pH和温度对牛蛙 消化酶活力的影响进行了研究，旨在增进对牛蛙消化生理特点的认识，为牛蛙人工养殖中环境因子的控制和饲料营养成分 的合理搭配提 供理论依据。1 材料与方法1.1 实验材料鲜活的成体牛蛙购自芜湖市黄

3、山西路菜市场，重250 300 g。将牛蛙毁髓处死， 剖腹，迅速取出胰脏和完整消化道。将消化道剪幵，用4C 预冷的 0.65 %的生理盐水快速洗净，按食道、胃、前肠、中肠和后肠 （直肠） 取材，用 吸水纸轻轻吸干，称重。1.2 酶液的制备根据所称得的消化系统各部分的质量，加入20倍质量的4 C蒸馏水，在冰水浴中 充分匀浆，捣成糜状，以2000 r/min的速度冷冻离心15 min，取上清液即为酶液。保存于4C冰箱中，8 h内分析完毕。1.3 消化酶活力的测定1.3.1 蛋白酶活力的测定 采用福林 -酚试剂法 11，略有改动。取 0.5 mL 1 %的酪蛋白溶液于试管中，分别加入不同pH值的缓冲

4、液2 mL ,混匀，30 C水浴预热5 min。在反应管中按食道、胃、前肠、中肠、后肠和胰脏顺序 分别加入0.25 mL、 0.25 mL、 0.5 mL、 0.5 mL、 0.5 mL 和 0.5 mL 预热的粗 酶液。恒温水浴锅控制反 应温度，充分反应15 min。立即加入1.5 mL 10 %的三氯乙酸终止反应，静置15 min o对照管在加入10 %三氯乙酸后再加酶 液。过滤， 取滤液1 mL,加0.55 mol/L的NazCOs5 mL,福林-酚试剂1 mL，摇匀。在30 C水浴中 显色15 min。用7200型分光光度计，680 nm波长 条件下测光吸收值。以30 C下每分 钟水解

5、酪蛋白产生1 Ag各氨酸作为1个酶活力单位 (U) o1.3.2脂肪酶活力的测定采用聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法 。取缓冲液2.5 mL和聚乙烯醇橄榄油乳化液2 mL于锥形瓶中，30 C保温5 min，然 后在锥形瓶中 加入 1.0 mL 酶液， 30 C 下反应 30 min 后立即加入 95 %乙 醇 5.0 mL 终止反应， 再加 3 滴酚酞， 用 0.05 mol/L 氢氧化钠滴定， 对照组 在加入 95 %乙醇后再加酶液，其余与 实验组相同。以 30 C 下每分钟作用 于聚乙烯醇橄榄油乳化液产生的脂肪酸最后消耗 1 mL 0.05 mol/L 的 NaOH 为 1 个酶活力单位( U)

6、o1.3.3淀粉酶活力的测定采用3,5-二硝基水杨酸比色法，略有改动。取0.665 mL预测粗酶液于各试管，再分别加入相应pH值的缓冲液0.665 mL，混匀，将 反应组置于30 C恒温水浴锅中预热510 min,同时对照组在100 C沸水中煮510 min (使酶失活)。再向反应组和对照组试管中加 入已预热的1 %的淀粉溶液0.67 mL，摇匀, 于30 C水浴反应20 min后再加入2 mL的3,5-二硝基水杨酸，摇匀。立即放入100 C沸 水中显色5 min， 使酶失活并终止反应， 流水冷却后稀释 10倍，用 7200型分光光度 计，490 nm波长条件下比色，测光吸收值。以30 C下每

7、分钟水解淀粉产生1 mg 麦芽糖作为一个酶活力单位( U)o1.3.4纤维素酶活力测定采用羧甲基纤维素钠水解法(4)。取1.0 mL酶液于各试管，再 分别加入相应pH值的缓冲液3.0 mL， 0.5 %羧甲基纤维素钠 溶液0.8 mL，蒸馏水0.6 mL，混匀40 C水浴糖化30 min，取出立即置于沸水浴15 min，对照组先置于沸水浴中使酶失活，其余步骤相同。取0.5 mL糖化液加3,5-二硝基水杨酸1.5 mL,沸水浴15 min，冷却，加蒸馏水3 mL ,用7200型分光光度计，于550 nm处测吸光值。以40 C每分钟催化纤维 素生成1.0 葡萄糖为一个酶活力单位（U ）。1.4 p

8、H梯度的设置利用不同pH值的缓冲液来调节反应的pH条件。实验中共使用4种缓冲液，以KCI-HCI配制pH 0.5-1.5的缓冲液，以NazHPOq -柠檬酸配制pH 2.2-8.0 的缓冲液，以巴比妥钠-盐酸配制pH 8.0- 9.6的缓冲液，以甘氨酸-氢氧化钠配制 pH 10.0-10.6的缓冲液。胃消化酶的pH值范围为1.0、1.5、2.2、3.0、4.0、5.0、 6.0、7.0和8.0,共9个pH值梯度。肠和胰脏消化酶 的pH值范围为4.0、5.0、 6.0、7.0、7.4、8.0、9.0、9.6 和 10.0，共 9 个 pH 值梯度。1.5温度梯度的设置设置 15 C、20C、25

9、C、30C、35C、40C、45C、50C、55C和60 C共10个温度梯度，根据上面所测胃、肠和胰脏各自的最适pH值，选择对 应的缓冲液按上述方法分别测定胃、肠和胰脏在不同温度条件下的 消化酶活力。1.6数据处理实验数据取3次测量的平均值（茂iSD），用单因素方差分析（one-way ANOVA）对不同部位消化酶的活力进行差异显著性比较，P0.05为差异显著。2结果2.1牛蛙消化酶的分布 牛蛙消化系统不同部位蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活力见表 1。由表4-1可知，牛蛙消化系统三种消化酶的活力均以胰脏最高，显著高于其它 部位（P0.05 ） 。在消化道中，蛋白酶活力以胃最高，显著高于食道和肠道（

10、P0.05） o 脂肪酶活力在消化道各段由前至后逐渐增加， 肠道脂肪酶活力 显著高于胃和食道（P0.05），其中后肠脂肪酶活力显著高于前肠和中肠（P0.05）o淀粉酶活 力主要分布于肠道，肠道各段淀粉酶活力显著高于胃和食道（PvO.05），肠道各段间淀粉酶活力差异不显著（P0.05）。食道和胃淀粉酶活力大小相当，差异 不显著（P0.05）。我们还对牛蛙消化道纤维素酶的活力进行了检测，结果未观察 到明显的酶活力。n=3; X 士 sd； Un it: U/g食道esophagus壬 胃stomach前肠foregut中肠midgut后肠hin dgut胰脏pan creas蛋白酶活力Activi

11、ty of14.5b 翌.5116.6a 17.37.98b 1.724.7b 士.03.63b .6118.6a 24.3protease脂肪酶活力ddccba0.14 ).010.18 ).020.27 ).020.29 ).050.36 ).073.67 ).10Activity of lipase淀粉酶活力Activity of0.14 ).010.17c .021.02b).091.12b).081.05b).043.34 生).05amylase注：上标不同的平均值间差异显著，a b c d ( P 0.05)2.2 pH对消化酶活力的影响2.2.1 pH对蛋白酶活力的影响不同pH

12、值条件下，牛蛙胃、肠道和胰脏 蛋白酶的活力变化情况见图1。由图4-1可知，三个部位蛋白酶活力与 pH关系均呈单峰型，最适pH值分别为2.2、7.4和9.6。胃蛋白酶在pH值1.5-2.2范围 内显示较强的活力，pH值为2.2时最高，pH值大于2.2后胃蛋白酶的活力急剧下 降, pH值为6.0时酶活力只有最大活力的5.0 %左右。肠蛋白酶活力在pH值4.0-6.0范围内变化较平缓，在pH值6.0-7.4范围内随pH值的升高而快速升高，在 pH值7.4时达到最大值，pH值继续增大时酶活力逐步下降。胰蛋白酶活力在pH值大于4.0时迅速增加，pH值为9.6时达最大值，pH值为10.0时胰蛋白酶活力又迅

13、速下降。肠 IntestinexioeeaetorpfO。胰 Pancreas150vyLV1005010110.50.40.30.20.1234567891011pHl pH value-a- 胰 Pancreas /10胃 Stomach肠 IntestinepHf pH value图4-1 pH对蛋白酶活力的影响222 pH对脂肪酶活力的影响不同pH值条件下，牛蛙胃、肠道和胰脏脂肪酶的活力 变化情况见图4-2。由图4-2可知，胃、肠道和胰脏脂肪酶活力与pH关系曲线均呈 单峰型，最适pH值分别为2.2、7.4和8.0。胃脂肪酶活力在pH值1.5-2.2范围内 上升较快，pH值为2.2时达最

14、大值，pH值大于3.0后胃脂肪酶的活力又不断下 降, pH值为7.4时酶活力只有最大活 力的17.0 %左右。肠道脂肪酶活力在pH值 为5.0-7.4范围内迅速上升，在pH值为7.4时达到最大值，而后又迅速下降；胰脂 肪酶活力在pH值小于7.0时变化较平缓，pH值大于7.0时急剧上升，pH值为8.0时酶活力达最 大值，而 后迅速下降。223 pH对淀粉酶活力的影响不同pH值条件下，牛蛙胃、肠道和胰脏esapA to wv-tlvu-c酶 肪力 脂活图 4-2 pH 对脂肪酶活力的影响蛋白酶的活力变化情况见图4-3。由图4-3可知，胃、肠道和胰脏淀粉酶的最适pH 值分别为7.0、8.0和9.6。胃淀粉酶活力与pH关系曲线呈双峰型，pH值对淀粉酶 活力影响很大。当pH值为2.2时有一个较小的峰值，接着在pH值值为7.0时又有一个较大的峰值，且此时酶的活力大约是pH为2.2时的4-5倍。肠道和胰脏淀粉酶活力与pH的关系曲线均呈单峰型。在pH值小于7.0时，肠淀粉酶活力变化较平缓，pH值大于7.0时酶活力急剧上升，到pH值为8.0时达最大值，pH值继续升高时酶活力又急剧下降。胰 淀粉酶活 力在pH值大于5.0时上升较快，pH值为9.6时达最大值，然后随pH值升高酶活 力又急剧下降。* 胃 Stomach* 肠 Intestineesa*胰 Pancreas /10wvma