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1、综合性实验报告实验名称：小型发酵罐的使用与发酵 过程中主要生化指标测定 实验性质：综合性实验 所属课程名称：发酵工程工艺原理 班级：2012级食品营养 3班 学号： 姓名：实验指导教师：实验时间：2014.12.012014.12.03小型发酵罐的使用与发酵过程中主要生化指标测定摘要：关键词：1 前言2 材料与方法2.1 材料2.1.1 菌种大肠杆菌(E.coli )2.1.2 培养基种子培养基：葡萄糖10g，蛋白胨10g,牛肉膏10g,酵母膏5g，氯化钠5g,水 lOOOmL。pH7.0。发酵培养基：葡萄糖20g,蛋白胨10g,牛肉膏10g,酵母膏10g,氯化钠5g,氯化铵 5g,水 lOO
2、OmL。pH7.0。全部用自来水配制培养基。2.1.3 其他材料泡敌、斐林试剂、0.1%标准葡萄糖溶液、40%氢氧化钠等。2.1.4 设备BIOTECH-7BGZ发酵罐1套(配套蠕动泵、pH电极、溶氧(DO)电极、空压机及所nrwS1Gl/4*-08wGl/4,-08V/2Gl/4,-08Gl/4 -水側进龄vi08-08釣排*V2Gl/4-V3MioWGl/4,-0&AlG3/8*鉴刑创Pi)JIJ2无亦财5M咲J3鼠料斜費宾阀门表序 号连接尺寸标 准用途或名称N1G1/2电加热N2G1/2电加热N3G1/4盘管排水口N4G1/4夹套进水N5G1/4夹套溢流口N6M14*1.5温度电极接口N
3、7G1/4盘管进水/蒸汽口N8M10平衡口N9M27*2接种口N10Pg13.5补料口N11Pg13.5溶氧电极插口N12G3/4三孔补料口N13Pg13.5排气口N14消泡电极插口N15补料口N16M16*1.5进气口N17Pg13.5pH电极插口N18取样品K108排气过滤器出口K206排气过滤器排液口K306排气冷凝器进水口K406排气冷凝器回水口K506进气过滤器平衡口K604无菌空气出口K708空气进口K804无菌空气进口K908取样/物料出口管口表3 实验方法3.1 流程培养24h培养12h培养10h菌种 一斜面 * 一级种子 二级种子37 C (250mL 摇瓶 37 C (50
4、0mL 摇瓶)37 C培养基”T8 10h_发酵罐管路准备一”实罐灭菌发酵C 放罐取样分析测定图 1 发酵过程流程3.2 菌种准备3.2.1 配制培养基配制种子固体培养基100mL，分装试管，O.IMpa (121C )灭菌20min,摆成斜面。配制种子培养液600mL，分别分装50mL于两个250mL三角瓶中(作一级种子瓶)， 余下550mL平均分装于三个500mL三角瓶中(作二级种子用)，同上灭菌备用。3.2.2 接种与培养(1) 菌种活化上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜面，37C培养24h。(2) 接一级种上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子瓶，37C振荡(125r/min)培养12h。
5、分别 测接种前和培养结束时的OD值，计算出净增OD，并作记录。(3) 接二级种将一级种转接二级种子，接种量5%。之后，37C振荡(125r/min)培养10h。3.3 上罐前的准备洗净发酵罐及各联接胶管。配制发酵培养基5000mL，置发酵罐内，加入几滴泡敌。校正pH电极和溶氧(DO)电极。安装好发酵罐，把电极插口、取样管、补料口、消泡剂料瓶等固定、密封好后，开 夹套出、进水阀V2、W1，使夹套充满水。3.4 实罐灭菌用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀V4,启动 蒸气发生器，启动搅拌马达，调转速300r/min，开启冷凝水出水阀VI，开启蒸气阀门S1,进行在位灭菌。
6、当保护罩顶部阀门V4有烝气排出时，2min后关闭阀门，当罐温接近灭菌温度时， 微开阀V4适当排气，并调整蒸气阀S1维持罐温。保温结束后，关蒸气阀S1,全开冷凝 水出水阀VI,开进水阀W3，将温度设定在37C，切入自动。灭菌完成后，关闭蒸汽发 生器并排去蒸汽发生器内残汽。当温度降到100C以下，缓缓开排气阀V4,使保护罩顶压力表指示为零，移去保护 罩。连接通气管路，将进气过滤器K7 口与控制台左侧空气出口连通，开弹簧夹，接通 空气压缩机电源，对发酵罐进行通气，调整空气流量35L/min。温度达到37C时，将预先灭菌的pH电极、DO电极（75%酒精消毒、UV消毒）接入 发酵罐，连接各电极导线。流加
7、碱的管线与泵和罐体连接，通过面板操作开关选择碱泵，打开手动开关，使胶 管内充满液体，将输出上限设在15%，下限设为“0”，待一切准备就绪，将“手动”开 关调节到“自动”状态。设定搅拌转速为300r/min、空气流量23L/min、pH7.0、DO100%，系统进入发酵 状态。开启电脑，并与发酵罐主控设备相联。打开控制软件，做好实时监控和记录发酵全 过程的准备。3.5 发酵操作3.5.1 取样当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后，开始取样（用于接种前培养基成分分析：） 松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧2,将出料管放入接料 瓶，松开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入接料瓶，开
8、J2、J3排出取样管内残料，夹紧 J2、J3。3.5.2 接种将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口，点燃酒精棉，在火焰保护下，打开接种 口，倒入二级种子，然后旋紧接种盖，移去火焰圈。接种后立即进行第一次取样，用于 测定发酵液零时OD值。3.5.3 电脑监控打开电脑，启动软件，进行实时监控。3.5.4 发酵管理注意发酵罐运转是否正常，检查各控制参数是否在合适的范围内，遇有故障及时排 除。（例：当在某一时段泡沫大量生成时，系统消泡不运转，可用手动加入几滴消泡剂）每小时取一次样，每次取样50mL。取样时，用量筒准确取流出的培养液50mL,对号倒 入三角瓶中，封口，立即放入冰箱保存。每小时记录发酵过程温
9、度、pH、DO、通风、转速的数值，并记录操作情况。3.6 发酵过程中各项生理指标的测定3.6.1 0D值测定均匀取样品5mL于编号试管中，用空白发酵液稀释至一定浓度，在21分光光度计上 测定A 0根据菌体浓度与吸光度之间关系的标准曲线换算出菌体浓度。600其余发酵液于2000r/min条件下离心分离8min，上清液入编号三角瓶，用于测糖。3.6.2 葡萄糖测定（1）样品处理用蒸馏水对样品液进行稀释待用。（2）标定碱性酒石酸铜溶液分别吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加入 玻璃珠2粒，混匀，从滴定管滴加约9mL葡萄糖标准溶液，控制在2min内加热至沸 腾
10、，趁沸以每 2 秒 1 滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终 点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积，同时平行操作三份，取其平均值，计算每10mL （甲、乙液各5mL ）碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量（mg）。（3）样品溶液预标定分别吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加入 玻璃珠2粒，混匀，控制在2min内加热至沸腾，趁沸以先快后慢的速度，从滴定管滴 加样品溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每两秒 1 滴的速度滴定，直 至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积。（4）样品溶液测定分别吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加入 玻璃珠2粒，混匀，从滴定管滴加比预滴定体积少1mL的样品溶液，使在2min内加热至沸腾，趁沸继续以每两秒 1 滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积，同法平行操作 3 份，得出平均消耗体积。
