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1、白血病免疫分型测定方法流式细胞仪 (BeckmanCoulter，贝克曼库尔特 )原理：三色直接免疫荧光法。 正常血细胞的分化成熟过程中， 细胞膜、细胞浆有抗原的表达与血细胞的分化发育阶段密切相关， 因此这些抗原的表达与否可作为鉴别细胞和其分化阶段的基础。 利用荧光素标记的单克隆抗体对血液或骨髓进行染色，通过 FCM对白血病细胞细胞膜和细胞浆抗原进行分析， 由此了解所测白血病细胞的系列属性及其分化程度。三色染色在白血病免疫分型中较为常用。根据分型需要， 选择相应抗原的标记抗体， 一般 FITC 标记抗体和 PE标记抗体搭配为一组，再加 PC5标记抗原 CD45单克隆抗体，共三种抗体加入一管标本
2、采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态，腰穿采骨髓。采集部位腰穿采骨髓抗凝剂肝素抗凝要求1样本量至少 3ml。2 样本应在采集后 6 小时内处理，冷冻的标本或已固定的标本不能用。3 样本白细胞计数应在 4.0-10.0 109/L 之间。若 10.0 109/L ，样本需要稀释， 用 PBS稀释；若4.0 109/L ，应分离单个核细胞。4溶血样本不能用。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1 ：单克隆抗体液体1ML 2 82：全血溶血试剂液体A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温3： IntraPrep Permeabilization
3、Reagent成分 1（固定剂）液体5ml室温成分 2（透膜剂）液体5ml室温4：鞘液液体20L室温5：清洗液液体5L室温6：荧光微球液体10ML 2-8质控品BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于 2-8 保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于 2-8 可稳定 2 周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra操作 - 样本制备 ：细胞膜表面抗原1首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。2首先每管中加入5ul CD45-PC5 抗体。3然后，按管上的标记，加入相应抗体各10ul( 注意：必须是FITC 和
4、 PE 标记的抗体搭配 )4各管中加入标本 ( 骨髓或外周血 )30 100u1(根据细胞的多少决定 ) ，振荡混匀，室温避光 2030 分钟。5溶血： a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血 )b. 使用 COULTER QPREP制备系统开机 - 显示 READY灯亮 - 选择 35SEC灯亮 -关门 - 自动进行溶血 - 显示 READY灯亮 -开门 - 开门 -放入试管取出试管- 再进行下一个样品测定。（* 溶血前确认 A/B/C 管路充满并能打出液体）细胞浆和核抗原1准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体，其中一管是同型对照。2首先每管中加入标本( 骨髓或外周血)100ul(
5、 根据细胞的多少决定) ，5ulCD45-PC5抗体。室温避光 20 分钟。3每管中加入固定液100ul ，剧烈振荡混匀，室温避光15 分钟。4各管中加入 PBS4ml。5300g 离心 5 分钟后，弃去上清液，振荡混匀。(1500r/min*5min)6各管中加入透膜剂100ul ，轻轻混匀，室温避光5 分钟。7加抗体，阴性对照管中加入10ul ，其余各管加入相应抗体各10ul ，室温避光 15 分钟。8各管中加入 4mlPBS，振荡混匀。9300g 离心 5 分钟后，弃去上清液。10各管中加入 PBS500ul，振荡混匀。11上机测样报告结果报告百分数操作性能精密度批内五次重复 CV2灵敏度500 1000 个荧光素分子参考值CD34+5%MPO+5%粒系 20%淋系 30%临床意义用于血液病的诊断和分型诊断方案（ Protocol ）
