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1、1第五章荧光分析法第一节第二节第三节荧光分析法的基本原理荧光定量分析方法荧光分光光度计某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，发射出比原来所吸收光的波长更长的光光致发光（二级光）荧光 fluorescence光致发光磷光 phosphorescence荧光分析法是根据物质的荧光谱线的位置及其强度进 行物质鉴定和含量测定的仪器方法。3分子荧光分析的特点:1. 灵敏度高：一般紫外一可见分光光度法的检出 限约为107g/ml,而荧光分析法的检出限可达到 10 10甚至 10 ,2g/mL2. 选择性好3线性范围宽4.应用范E第一节荧光分析法的基本原理、分子荧光molecular fluoresc
2、ence1.分子荧光的产生分子能级比原子能级复杂在分子体系中，每个电子能级上都存在振动、转动能层室温下大多数分子处于基态的最低振动能层在基态时，含有偶数个电子的分子，电子的叫为+1/2和 1/2, xO, A7=lo则该分子所处的电子能态称为基态单重态, 用符号几表示分子吸收辐射后激发态基态亠基态激发阜產态激发三車态T电子自旋状态f卜电子被激发且不发生自旋方向的改变”兀为+1/2和1/2,=0,则该分子所处的电子能态称为激发单重态,用符号S表示。（S】S2 Sj）电子被激发且伴随着自旋方向的改变 叫为+1/2和+1/2, s=l, M=3。则该分子所处的电子能态称为 激发三垂态，用符号卩表示。
3、（许T2卩3）小结：分子能级与跃迁基态（S）i激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁-次到位;激发态T基态：多种途径和方式（见能级图）；速度最快、激 发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大；第一、第二、电子激发单重态久、s2.；第一、第二、电子激发三重态7、卩2；电子能级的多重性M=2S+1平行自旋比成对自旋稳定（洪特规则），三重态能级比相 应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；7 丁匕小结：激发单3E态与激发三玉态的不同 激发单态分子中没有净电子自旋,因而具有反磁性； 激发三垂态有2个自旋平行电子，是顺磁性的激发单重态分子平均寿命短（10丄10塚），而激发三重态 的长（l（Hi（
4、）s）基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方向的 改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻 跃迁StSi、S2 允许跃迁；T2禁阻跃迁；通过其他途径进入 （见能级图）；进入的几率小；激发态一基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁（发光）和无辐射跃迁等方式失去能量;传递途径荧光：第一激发单重态的最低振动能级T基态磷光：10410s；第一激发三重态的最低振动能级一基态生辐射和非辐射能量传递过程噥9弛除：同一电子能级中,以热能交换形式由高振动能 层至低相邻振动能层间的跃迁。发生振动弛強的时间10T2s 内转换：相同多重态的电子能级间的等能级的无辐射
5、跃迁。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激 发单重态的最低振动能级。发生内转换的时间lO So荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能层-基态（荧光多为SlS。跃迁），发射波长为/的荧光，10710対。 发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长：兄 丫 2 2 无外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质分子之间碰撞引起的 转移能量的非辐射跃迁。常发生在，或外转换使荧光或碱光减弱或“猝灭”。系间跨越：激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发 生变化的非辐射跃迁。禁阻跃迁，但当能层有较大重叠时,-7就可发生系间 跨越，通过自旋一轨道耦合进行。106s磷光发射：电子由第一激发三重态的最低
6、振动能级-基态（右 九跃迁）；发光速度很慢：10 100s.磷光的能比荧光小 电子由进入“的过程：（S。-“禁阻跃迁）S。-激发-振动弛豫-内转移-系间跨越一振动弛豫-7 光照停止后，可持续一段时间2.荧光的激发光谱与荧光光谱excitation spectrum and fluorescence spectrum荧光分子都具有两个特征光谱； 激发光谱和发射光谱（荧光光 谱。（1）荧光的激发光谱激发光谱：表示不同激发波长 下所引起物质发射某一波长荧光的 相对效率。绘制激发光谱：固定发射波长 （选最大发射波长）,然后以不同波长的 入射光激发荧光物质，以荧光强度F对 激发波长入作图，即为激发光谱。
7、A/nm養的激发光（1）,荧光 （II）和磷光（111）光谱图激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强 度最大，称为最大激发波长入劭（2）荧光的发射光谱（荧光光谱）荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强 度。绘制发射光谱时，使激发光波长固定在入冲处，然后对发 射光谱扫描，测定各种波长下相应的荧光强度，以荧光强度 F对发射波长入作图，得发射光谱图（即荧光光谱）。发射光谱（荧光光谱）的位置？磷光光谱的位置？激发光谱与发射光谱的关系a. Stokes位移荧光光谱总是位于物质激发光谱的长波一侧，即荧光波 长大于激发光波长的现象。激发光谱与发射光谱之间的波长差值： 振动弛豫、内转换等
8、物辐射跃迁损失了部分能b.荧光光谱的形状与激发波长无关电子可以跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量 （如能级图彳2、兄产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一 个发射态，如兄3。为什么？镜像规则由于电子基态的振动能级分布与激发态相似,故通常审积 波长镜像規则长振有峰跃关 波与差小与有 峰值级各度率 小减能，高几 各递动关的迁0-*2 02r=17荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动 能级分布类似；基态上的某振动能级若跃迁到第一激发态的某振动能 级的几率较大的话，相反跃迁也如此。的乙酵溶液的荧光光谱（右）和吸收光谱（左）图遐?駅$-荧光的产生与分子结构
9、的关系 relation between fluorescence and molecular structure1 分子产生荧光必须具备的条件(1)具有合适的结构;(2)具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率(q)：发射的光量子数 吸收的光虽子数如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为100%。物质的荧光量子产率范围一般是多少？19 2.有机化合物的分子结构与荧光的关系(1) 跃迁类型：兀* f兀的荧光效率高，系间跨越过程的速 率常数小，有利于荧光的产生：(2) 共觇效应：提高共辄度有利于增加荧光效率并产生红移(3) 刚性平面结构：可降低 分子振动，减少与溶剂的相 互作用，故具有很强的
10、荧光O如荧光素和酚猷有相似结 构，荧光素有很强的荧光， 酚舐却没有。取代基效应：芳环上 有供电子基，使荧光增强。化合物分于式烫Jt玻长右/run处光的郴対銭友葦270- 31010甲苯CJi.CHj270 32017丙苹C且270- 32017代苯GH,F270- 32010代c”ci275- 3457m代苯CeH,Br290 3805代萃CHI0革CJJQH285 36518A子310 40010甲CJijOCH,285 34520笨胺310 40520* W K子CHsNH；0*甲C”COOH310 3903C4H,CN28036020*QHg021三、影响荧光强度的因素relation
11、between fluorescence and molecular structure影响荧光强度的外部因素1 溶剂的影响同一物质在不同溶剂中，其荧光光谱的形状和强度都有差别。 一般悄况下，荧光波长随着溶剂极性的增大而长移，荧光强度也有 所增强。这是因为在极性溶剂中，元T於跃迁所需的能量差小， 而且跃迁几率增加，从而使紫外吸收波长和荧光波长均长移，强度 也塢强溶轴粘度减小时，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁增加而荧光减弱。故荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。由于温度对 溶剂的粘度有影响，一般是温度上升，溶剂粘度变小，因此温度上 升，荧光强度下降。2 温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度増
12、加，分子运动速度加快，分子间碰撞的几率增加，外转换去活的几率增加，荧光效率降低。例如荧光素钠的乙醇溶液，在(TC以下，温度每降 低10X?, 0増加3%,在一8()C时，S为1。对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制;3.溶液pH当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值对该荧光物质的 荧光强度有较大影响，这主要是因为在不同酸度中分子和离子间的 平衡改变，离子结构发生变化，因此荧光强度也有差异。每一种荧 光物质都有它最适宜的发射荧光的竝羽式，也就是有它最适宜的 pH值范围。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡关系：pH13苯胺在pH712的溶液中主要以分子形式存在，由于-NH2为提高荧 光
13、效率的取代基，故苯胺分子会发生蓝色荧光。但在pHv2和pH13的溶液中均以苯胺离子形式存在，故不能发射荧光。4内滤光作用和自吸现象内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铅酸钾;自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收250330400500 x/nm蕙的乙酵涪液的荧光光谱（右）和吸收光谱（左）图光谱的长波长端更叠，产生自吸收；如蔥化合物。* 5.荧光熄灭剂荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互 作用引起荧光强度降低的现象。引起荧光熄灭的物质称为 荧光熄灭剂（quenching medium）o如卤素离子、盍金属离子 、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物.燕基和竣基化合 物均为常见的荧光熄灭剂。#6、散射光小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射。瑞利光：光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只 是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。拉曼光：光子和物质发生弹性碰撞，发生能量交换，光子把 部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量。从而 发射出比入射光稍长或稍短的光。散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长 的拉曼光，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须采取 措施消除。拉曼光的干扰主要来自溶剂，当溶剂的拉曼光 与被测物质的荧光光谱相畫叠时，应更换溶剂或改变激发 光波长 27选择适当
