《小鼠脾脏原代细胞》由会员分享，可在线阅读，更多相关《小鼠脾脏原代细胞（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、小鼠脾脏原代细胞培养与细胞死活鉴定和计数一、实验目的1学习掌握细胞培养的基本原理及具体操作方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养2. 掌握并熟悉无菌操作的要点，并养成无菌操作的习惯3学习用染色法鉴别细胞死活并进行细胞计数4学会利用血球计数板对细胞总数和活细胞进行计数二、实验原理 细胞培养：多细胞生物的细胞可以被分离出来，然后在体外特殊培养环境中继续存活，并保持其生 理、生化特性直接从生物体分离出来，在体外培养过程中尚未分裂、增殖的细胞，称为原代 培养细胞。原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖，在数量上大量扩增，这时就成为继代 培养细胞。细胞培养基要满足细胞的生长需要，培养细胞的条件有水的质量、无菌环
2、境，最适温度、 渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。细胞培养皿是特殊制造的使细胞可 以贴壁。细胞培养箱常指二氧化碳培养箱。它可以提供合适的温度和二氧化碳浓度。二氧化碳和 培养基中的缓冲系统共同作用，保持细胞培养液的酸碱度。超净台通过将空气进行过滤，为 细胞培养的各种操作提供了一个干净的环境，使细胞培养免于细菌和真菌的污染。 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法：活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：I细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用， 只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了
3、以 台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细 胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。II.代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。 基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素 二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易 被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧 光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的 绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失
4、去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜 下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染 料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧 化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代 谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝 色或淡蓝色。活细胞必需通过控制物质进出细胞膜来保持内部生理环境的稳定性。细胞死后细胞膜通 透性发生改变，原先不能进入细胞的物质也能够进入细胞。台盼蓝染料正常情况下被活细胞 阻拦在细胞膜外，只有细胞膜受损或者细胞死亡后，才能进入细胞
5、。因此，活细胞一般不能 被台盘蓝染色，而死细胞会被染成蓝色。伊红和苏木精是最常用的细胞染色剂。本次实验就是用这两个染色剂进行的。 血球计数板的使用：血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较 宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网。每个方格网共分9 大格，其中间的一大格（又称为计数室）常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种 是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成 25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有 一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格
6、组成。每个大方格边长为1mm,则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1 /400mm2,盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室（大方/ 1! / f z0.100mm1 2mm400/k j j i图2血球计数板的构造（a、平面图；b、侧面图）b 图1血球计数板网格的分区和分格格）的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l/4000mm3。使用血球计数板直接计数时，先 要测定每个小方格（或中方格）中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物 细胞的数量。三、实验材料1材料小鼠脾脏；PBS缓冲溶液、培养液、台盼蓝、伊红；2器材解剖剪、解剖镊、
7、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射 器、针头、Eppendorf管（上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好）；倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板等。四、实验步骤原代细胞培养步骤：1）取材：取小白鼠一只，采用断头法处死，清水洗净小白鼠并浸于75%酒精中灭菌3min, 取出转入超净工作台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔，取出脾脏，去除周围的脂肪组 织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1-2次，转入无菌玻璃培养皿中，待用。2）分离脾细胞：用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用L形针头注射 器在皿内吸取PBS液0.2ml,然后将其沿脾脏长轴方向注射
8、入脾内，用针尖在脾脏上扎 眼,并用L形针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲洗脾脏并吹散挂 出的脾细胞，稍微倾斜并静置l-2min,吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入 Eppendorf 管，以 3000 转/分离心 l-2min。3）培养脾细胞：从超净工作台中区塑料培养皿一个，用“枪（1ml）”加入细胞培养液2ml， 并在皿上做记号，待用。取上述离心后的Eppendorf管，在超净工作台内打开弃去上清 液，用“枪（200“ l）”吸取塑料皿中的培养液400ul，加入弃去上清液的Eppendorf 管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ul脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿
9、中， 混匀，然后放入37C二氧化碳培养箱中培养。细胞死活鉴别步骤台盼蓝法染色：1）细胞悬液制备：将生长有贴壁型细胞的培养瓶（皿）中的培养液倒入干净试管中，向 培养瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液1-2ml，静置3-5min，待 见到细胞变圆，彼此不连接为止，弃去混合消化液并将上述试管中的培养液倒回培养 瓶中，用滴管轻轻吹打细胞，制成细胞悬液。2）染色制片：取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合, 2min后制成临时装片，镜检。3）染色结果：死细胞染成蓝色，活细胞不着色。用血球计数板进行细胞计数：1）染色计数：取上述步骤二所制备0
10、.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加等体积滴染液, 混合2-5min,滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，使悬液 自然充满计数板小室（注意：不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加；在普通光 镜10x物镜下计数四个大格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右）。2）根据染色结果计算活细胞率：依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率:活细胞率细胞总数-死细胞数细胞总数x100%五、实验结果 原代细胞培养结果在倒置显微镜下，原代培养的细 胞清晰可见，细胞聚集于培养液中， 多呈圆形，形状规则，细胞质均匀。 培养液要比原培养液的粉红色略淡 而略偏黄色，因为在细胞生长中培养 液的pH会变化。本次培养的原代细 胞浓度较大，效果较好。倒置显微镜下10X40倍数观察的原代细胞* i,知“图为血球计数板中的死活细胞、 鼻观察。可以明显观察出死活细胞的区另聽黑色箭头所指是活细胞，其外周活细胞率(%) =细胞总数-死细胞数细胞总数X100% =(28XX；驚
