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1、聚合酶链式反应定义1:用引物和DNA聚合酶进行体外扩增特定的DNA区域的一种技术。应用学科：生态学（一级学科）；分子生态学（二级学科）定义2：体外酶促合成特异脱氧核糖核酸片段的技术。应用学科：水产学（一级学科）；水产生物育种学（二级学科）定义3：通过DNA互补双链解链、退火和聚合延伸的多次循环来扩增DNA特定序列的方法。应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）定义4：由穆利斯（K. B. Mullis）于1988年首创的一种在体外模拟发生于细胞内的DNA快速扩增特定基因或DNA序列的复制过程的技术。应用学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）以上内容由全国科学技术名
2、词审定委员会审定公布求助编辑百科名片概述DNA聚合酶（DNApolymerase I）最早于1955年发现，而较具 有实验价值及实用性的Klenowfragment of E. Coli则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发 现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性，因此不符合使用高温变 性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶（简称Taq polymerase）,则是于 1976年从温泉中的细菌（嗜热菌）（Thermusaquaticus）分离出来的。 它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于 80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是 于19
3、71年由Dr. Kjell Kleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂性基 因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的 PCR则于1983由Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务 于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis并 于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR 的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法 难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用， 成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了 1993年诺 贝尔化学奖。DNA的半保
4、留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在 多种酶的作用下和接近沸点的温度下加热可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子 挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度 降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性 和复性，加入设计引物，因为DNA聚合酶需要一小段双链DNA来 来引导双链的合成。事实上，新合成的DNA链的起点是由加入在反 应混合物中的一对寡核苷酸也就是引物在模板DNA链两端的退火 位点决定再加上DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入
5、新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约技了 PCR术 的应用和发展。发现耐热DNA聚合酶-Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义， 该酶可以耐受90C以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使 PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大 量应用，并逐步应用于临床。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依 赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三 个基本反应步骤构成模板DNA的变性:模板DNA经加热至93C左右一定时间（一般为2030秒）后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合
6、，为下轮反应作准备； 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下， 以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制 原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩日的基因扩增放 大几百万倍。PCR反应体系与反应条件1.标准的PCR反应体系PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：引物（PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中
7、需要Mg2+）。引物的多种设计方法，与PCR在实验中的日的决定。但基本原 则相同长产物片段与短产物片段引物延伸所获得的新片段最初长短是不整齐的，分为长和短二种。短的是严格的限定在二个引物5端之间的，这正是需要扩增的片 段，而长的带有不需要的尾巴。长和短产生原因是引物所结合的模板 不同而造成的。以一个拷贝的原始模板为例，也就是只有一条待扩增的双链DNA链。长产物片段：在第一个反应周期中，以二条互补的DNA链为模 板，引物从3端延伸。延伸片段的5端是一端人工合成的引物。是特 定的，但是3端没有特定的止点。进入第二个周期，引物除与原始模板结合外，还要与新和成的链，也 就是长产物片段，结合。引物在与新
8、链结合时，由于新链模板的5端是固定的，就等于这 次延伸的片段3端被固定了止点。保证了新片段是起点和终点都限定 于引物结合位点以内。成为长短一致的短片段。为什么短产物片段按指数增加，长产物片段按算数倍数增加呢？由于半保留复制，不断产生新的长产物片段，引物一结合，就成 为短的产物片段。所以长产物片段几乎可以忽略不计。所以PCR反应产物不需要再纯化。就能保证足够纯的所需扩增 的DNA片段。用于进一步分析和研究。是按照与扩增区段两端序列彼此互补原则设计的。所以每一条新 生链的合成都是从引物的退火结合位点开始，按5到3方向延伸。 每一条新合成的链都具有新的引物结合位点。然后再加热，进入下一 轮。随着循环
9、次数递增新和成的引物延伸链急剧增多而成为主要的模 板。所以PCR将受到所加的引物5末端的限定。其终产物序列是介 于二种引物5末端之间的区域。PCR最后结果：PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu。分别来自两种不同的嗜 热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错 功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一 纯度必须较高，第二浓度不能太高以免非特异性增加，也就是合成不 需要的DNA缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情
10、况下也可使用铉根离 子；二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需 调整；辅助成分，常见的有DMSO （对DNA聚合酶IKlenow片段是有 益的，但对于Taq聚合酶有抑制作用，所以一般反应中不用，但是在 复合PCR中使用）、甘油（加入5%15%，有助于复性，尤其对G+C含量高和二级 结构多的靶序列，以及扩增长片段，也就是大于1500碱基对更实用。 但是并不对所有的PCR有益，所以要摸索），氯化甲基四铉TMAC， （在反应中加入1*10的副五次方1*10的副四次方mol/L的TMAC 可促进PCR去除非特异性扩增，而不抑制TaqDNA聚合酶）等，主 要用来保持酶的活性和帮助DNA
11、接触缠绕结构这些辅助成分也叫添加剂，它可以消除引物和模板的二级结构，降低 DNA双链的解链温度，使DNA双链变性完全，可增进DNA复性时 的特意配对，增加或者改变DNA聚合酶稳定性以提高PCR扩增效率。现已发现不同温度条件下添加剂会影响Taq酶的半衰期。反应加入小牛血清白蛋白100微克每毫升或明胶0.01%，或者 Tween20,0.050.1%有助于酶的稳定。加入5豪摩尔的二硫苏糖醇也 有类似的作用尤其在扩增片段长时，此时延伸时间也长，可加入这些 酶保护剂。但是不能加入太多，否则会抑制PCR扩增2、PCR引物设计PCR反应中有两条引物，即5端引物和3引物。设计引物时以一 条DNA单链为基准（
12、常以信息链为基准），5,端引物与位于待扩增片 段5,端上的一小段DNA序列相同（与3撇端互补）；3,端引物与位于 待扩增片段3,端的一小段DNA序列互补。？引物设计的基本原则 引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳， G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上 的嘌吟或嘧啶核苷酸的成串排列。 引物内部不应出现互补序列。最低限度是不能连续四个碱基互 补 两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3，端的互补重 叠。 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3, 末端连续8个碱基在待扩增区以外不能
13、有完全互补序列，否则易导致 非特异性扩增。 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求 配对，最佳选择是G和C。引物3，端不可修饰。应为保守序列。 引物的5端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点， 用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码 子、终止密码子等。v引物设计软件Primer Premier5.0 （自动搜索）*vOligo6 （引物评价）vVector NTI SuitvDNAsisvOmigavDNAstarvPrimer3 （在线服务）3、模板的制备PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。但是RNA扩增需要 先反转录成cDNA才能进行正常的P
14、CR循环。模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞 等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多 数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌 酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用 乙醇沉淀后用作PCR反应模板。？（可以不用纯化而直接当成模 板？）此处需要打印：4、PCR反应条件标准体积：50到100微升 反应缓冲液：50mmol/L氯化钾，有利于引物的退火。如果大于该 数值，则影响抑制TaqDNA聚合酶的活性。有些反应中以NH4
15、替代K，其浓度为16.6mol/L10mmol/L 盐酸100ng/mL 明胶镁离子浓度总应比dNTPs的浓度高。是 1.5mmol/LTaq聚合酶需要镁离子。镁离子影响引物的退火， 模板与PCR产物的温度，产物的特异性，引物 二聚体的形成，主要是PCR混合物中的DNA模 板，引物和dNTP磷酸集团可与镁离子结合。所 以镁离子含量降低。而Taq聚合酶需要游离的镁 离子最好对每一种引物，每一种模板都进行镁离子的浓 度优化。如果引物和模板DNA原液中含EDTA等金属螯合 剂也会减低游离的镁离子浓度。最为常用的缓冲体系：1050mmol/L，tris.HCl,Tris是一种双极性离子缓冲液，改变反应液的缓冲 能力，如将Tris浓度加大到50mmol/L，PH8.9,有 时会增加产量。 模板：0.1微克，要根据具体条件加以调整。一般需10010的5次方拷贝的DNA 底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20200umol/L TaqDNA聚合酶 2.5U (100ul) 引物 浓度一般为0.10.5umol/L用0.2毫升的PCR管，反应体积最小为5微升，各反应成分按比例缩 反应温度和循环次数变性温度和时间95C，30s退火温度和时间低于引物Tm值5 C左右，一般在45
