发酵综合实验讲义

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1、发酵综合实验讲义巢湖学院化学化工与生命科学学院生物工程教研室2013年8月目录实验一 PCR 基因扩增 2实验二 单细胞蛋白的发酵生产 4实验三 200L 啤酒酿造 6附录 10实验一 PCR 基因扩增一、实验目的通过本实验学习 PCR 反应的基本原理与实验操作技术。二、实验原理聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。1985 年美国的 Mullis 等人发明了 PCR技术，在体外利用模板DNA、特定的寡聚核苷酸引物和DNA 聚合酶,通过 DNA 变性、复性和延伸过程合成一条互补的

2、DNA 链。反复重复 这一过程，模板DNA就可得到大量扩增。典型的 PCR 反应体系由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引 物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅 速扩增。PCR 反应的主要步骤是：1. 变性：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93C-94C ）使其变性解 成单链；2. 退火：人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的 基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩 增片段的长短；3. 延伸：耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72C将单核苷酸从引物的3端开 始掺入，以目的基因为模板从53方向延伸，合成D

3、NA的新互补链。PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg） 水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA 片段。但正因为PCR强大的扩增能力，PCR所用离心管、吸头和溶液等都要严 格灭菌，以防反应体系被外源DNA污染。三、仪器、材料与试剂1、仪器PCR 仪、台式离心机、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪、恒温水浴锅等2、材料模板DNA、dNTP混合物、引物对、Taq酶、PCR管、微量移液取样器、 移液器吸头、琼脂糖、 EB 等上游 Primerl: 5 / -ACCG GAATTC ATG GTA GAT CTG ACT AG（EcoR I

4、）下游 primer2： 5 / -ACCCG AAGCTT CCC GAT CTA GTA ACA TAG （HindIII）3、试剂PCR 缓冲液（10x,含 MgCl2）、无菌双蒸水、50xTAE、lOxloading-buffer 等四、实验步骤（一）质粒 DNA 模板的制备以碱裂解法从载有目的质粒DNA的大肠杆菌宿主中提取出目的质粒DNA, 作为后续PCR实验的DNA模板。（二）PCR 扩增制备目的基因1、在0.2ml PCR微量离心管中配制50卩1反应体系：lOxPCR buffer （含 MgCl2）5 yLdNTP Mixture4 yLPrimerll yLprimer21

5、yL模板 DNA1 yLTaq酶l yL无菌双蒸水37 yL总体积5O yL2、设置PCR仪的循环程序： 94 C 5min 94 C 90s 56C 1min 72C 90s 30 cycles 72C 10min（三）琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 结果PCR 反应结束后,取产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。配置 0.8%琼脂糖凝胶,50yL PCR扩增产物+6吐lOxloading-buffer，恒压电泳。凝胶成像仪观察电泳结 果。实验二 单细胞蛋白的发酵生产一、实验目的1、了解小型发酵罐的结构和灭菌方法；2、掌握发酵过程的控制方法。二、实验原理单细胞蛋白（Single-Cell-Protein,

6、简称SCP）是从酵母或细菌等微生物菌体 中获取的蛋白质。微生物细胞中含有丰富的蛋白质，例如酵母菌蛋白质含量占细 胞干物质的45%55%；细菌蛋白质占干物质的60%80%；霉菌丝体蛋白质占 干物质的30%50%；单细胞 藻类如小球藻等蛋白质占干物质的55%60%, 而作物中含蛋白质最高的是大豆,其蛋白质含量也不过是35%40%。单细胞蛋 白的氨基酸组成不亚于动物蛋白质,如酵母菌体蛋白,其营养十分丰富,人体必 需的 8 种氨基酸,除蛋氨酸外,它具备 7 种,故有“人造肉”之称。一般成人每 天吃干酵母1015g,蛋白质的需要量就足够了。微生物细胞中除含有蛋白质外， 还含有丰富的碳水化合物以及脂类、维

7、生素、矿物质,因此单细胞蛋白营养价值 很高。发酵过程即细胞的生物反应过程,是指由生长繁殖的细胞所引起的生物反应 过程。微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能,而且要赋以合适 的环境条件才能使它的生产能力充分表达出来。为此我们必须通过各种研究方法 了解有关生产菌种对环境条件的要求，如培养基、培养温度、pH、氧的需求等, 并深入地了解生产菌在合成产物过程中的代谢调控机制以及可能的代谢途径,为 设计合理的生产工艺提供理论基础。同时,为了掌握菌种在发酵过程中的代谢变 化规律,可以通过各种监测手段如取样测定随时间变化的菌体浓度,糖、氮消耗 及产物浓度，以及采用传感器测定发酵罐中的培养温度pH、

8、溶解氧等参数的情 况,并予以有效地控制,使生产菌种处于产物合成的优化环境之中。三、仪器、材料与试剂1、仪器（ 1 ）超净工作台（ 2 ）烘箱（ 3）恒温摇床（4）高压灭菌锅（5）分光光度计2、材料（1）酿酒酵母（2）移液管（3）三角瓶（4）吸耳球3、试剂YPD液体培养基/豆芽汁葡萄糖培养基/PDA液体培养基四、实验步骤（1）活化菌种（2）种子逐级扩大培养（3）接种至发酵罐（4）生物量测定利用分光光度计测 600nm 处酵母细胞的吸光值，可间接地反映细胞的多少。 每隔6h测定一次生物量。（5）发酵结束，清洗发酵罐五、注意事项1、整个实验过程要严格无菌操作，尤其是取样时。2、取样的动作要快、准确。

9、3、在用分光光度计测OD值时，要迅速，尽量避免细胞沉降所引起的误差。六、数据记录及处理根据所获得的不同时间点的生物量，绘制出酵母的生长曲线并总结酵母细胞 的生长规律。实验三 200L 啤酒酿造一、实验目的 熟悉啤酒酿造工艺及啤酒酿造设备的操作，锻炼同学在生产中分析问题和解 决问题的能力。二、实验原理 啤酒是酒类中酒精含量最低的饮料酒，而且营养丰富。啤酒发酵就是利用啤 酒酵母对麦汁中的某些组分进行一系列的生物化学代谢，产生酒精及各种风味物 质，形成具有独特风味的酿造酒。三、实验装置及其原辅料1、 原辅料 麦芽：澳麦麦芽、焦香麦芽 酒花：苦花、香花酵母：S-1892、 实验装置实验装置为微型啤酒设

10、备（引进山东中德设备有限公司） 本啤酒生产系统主要设备构成如下：（1）糖化系统：包括麦芽粉碎机、糖化锅、过滤槽、麦汁泵。（2）发酵系统：发酵罐、酵母添加罐。（3）CIP 洗涤系统：包括消毒罐、碱水罐、消毒车。（4）换热系统：薄板换热器。（5）制冷系统：包括冰水罐、冰水制冷机组、冰水泵。四、实验步骤1 、麦芽粉碎取大麦芽15-20kg （依麦芽质量定），焦香麦芽200-400g，将麦芽加入料斗 中，开始粉碎。 特别注意：大麦芽应当即粉即用，不宜长时间保存，更不可过夜。 焦香麦芽粉碎时，不得润水。2、麦汁糖化（1）设备消毒：在投料前，将糖化锅内加约60kg水，打开电加热开关，开 始加热。待水升温到

11、90C，停止加热。用该90C热水将整套设备（含换热器） 循环清洗消毒 20min。(2) 制备投料水：在糖化锅内加一定量的水(约70kg),同时打开电加热 开关，开始加热。加热过程中要开启旋涡阀和麦汁泵35min,以便混合均匀， 升温至50-55r，停止加热；打开有关阀门，启动麦汁泵，将投料水自过滤槽底 部泵入70 kg。(3) 投料(蛋白分解)：先启动过滤槽搅拌，将大麦芽粉投入过滤槽内，搅 拌均匀，停止搅拌，开始计时，保持温度521C，时间70min。(4) 制备兑醪水：糖化锅内继续加水至60kg，开始加热，升温至100C, 停止加热；开启有关阀门，准备兑醪。(5) 兑醪(淀粉糖化)：蛋白分

12、解结束，启动过滤槽搅拌，把醪液搅起，搅 拌的同时把100C热水从过滤槽底泵入，兑醪温至66C，停止进水，66C保持 80min。(6) 清洗糖化锅：打开排污阀，排掉糖化锅内残余热水，用清水清洗掉锅 内水垢等污物后，关闭所有阀门，等待过滤。(7) 静置：糖化结束，启动过滤槽搅拌58min，待醪液均匀后，静置10 15mi n，等待回流过滤。3、过滤(1) 麦汁回流：注意静止时间，到时要及时回流，开启有关阀门和麦汁泵， 将麦汁在过滤槽内回流5-10min，观察视镜内麦汁清亮后，切换回流阀到过滤阀， 将麦汁泵入糖化锅。(2) 测原麦汁浓度：过滤20min后，取样测原麦汁浓度。A. 热麦汁处理：从糖化

13、锅内取一测量筒麦汁，慢慢放入事先备好的自来水筒 内，降温至30C以下(可以用其他方法冷却，但不能误入冷水)，摇匀、放稳；B. 糖度测量：取量程为020 BX的糖度表一只，将有水银包的一端慢慢插 入麦汁，接近预计读数值(12 BX左右)时再松手，5min后读取麦汁凹液面处 糖度表的数值；轻轻取出糖度表，检查表上麦汁温度值，对应查出糖度修正值， 获得原麦汁浓度值(注：糖度计要轻拿轻放，用后清水洗净、擦干，妥善保管)。(3) 洗糟：原麦汁过滤至将近露出糟面时进行洗糟，开启耕糟机，泵入热 水至过滤槽进行洗糟，加完水后，停止耕糟，待形成新的滤层，再重复前面的过 滤程序，洗糟一般为 2-3 次，总加水量约

14、 25L。(4) 混合浓度测定：洗糟2-3次后，测定混合麦汁浓度。(5) 排糟：洗糟 2-3 次后，测混合麦汁浓度达到要求时，停止过滤，打开 出糟门，用出糟耙将麦糟排出。 特别注意：麦汁过滤过程中，若麦汁不清或过滤困难，可搅起醪液静止 lOmin,重新打回流，直至麦汁清亮。(6) 清洗：排糟完毕，即用水清洗过滤槽壁、过滤筛板及耕糟机。4、麦汁煮沸(1) 加热：麦汁液位超过电加热规定的液位后，开始电加热升温。(2) 麦汁煮沸：加热至麦汁沸腾时开始计时，煮沸时间90min，麦汁始终 处于沸腾状态；控制沸终麦汁浓度，若在规定时间内浓度未达要求，可适当延时。(3) 添加酒花：麦汁煮沸开锅5min和沸终

15、前10min，分别添加苦型和香型 酒花，加量分别为40g (0.04%)和20g (0.02%)。5、麦汁旋沉 煮沸结束，停止电加热。打开糖化锅锅底阀和切线打入阀，同时开启麦汁泵，在糖化锅内打循环10min，静止沉淀30min，进行麦汁冷却。6、管路杀菌糖化锅热水升温至90C，停止加热，将麦汁管路和换热器杀菌20min，杀菌 时稍开充氧阀，对充氧管同时杀菌，杀菌结束，关闭阀门。7、麦汁冷却 依次开启冰水阀和冰水泵，然后再开启麦汁阀、麦汁泵、氧气阀，进行麦汁冷却。控制冷却温度11.00.5C，将麦汁通入发酵罐。8、发酵( 1 )洗涤：( 4 步法)a. 水洗：发酵罐进料前，先用自来水间歇冲洗 15min。b. 火碱洗：排净残留水后，用45-50C、浓度5%的火碱溶液循环清洗30min (碱液浓度降低时要及时补充)，循环完毕，回收碱液(注意防护，操作时必须带防护器具，严禁肢体直接接触碱液)。c. 水洗：排净残留碱液后，再用自来水间歇冲洗15min，方法同a。d. 双氧水洗：排净残留水后，再用浓度1%的双氧