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1、实验题目：突变体质粒构建一一PCR法背景与原理：蛋白与蛋白间，蛋白与核酸间相互作用是后基因组学研究重要内容之一，而体外突变技 术则是研究这种复杂关系的一个有效手段。通过 PCR 方法可向目的 DNA 片段中引入任何 所需的变化，包括碱基的添加、删除、点突变等PCR定点突变迅速、高效并且重复性好, 是基因研究工作中一种非常有用的手段。其基本原理可简述如下图：产物 I第一轮PCRV产物 II第二轮 PCR退火v延伸8 个循环后加入引物 1/引物 4本实验拟在某基因编码区（CDS）内，通过PCR定点突变引入一个EcoRI酶切位点。 该基因片段长724bp,上下游分别以XhoI和BamHI两个酶切位点
2、插入真核表达载体 pcDNA3.1,即卩pcDNA3.1-CDS。此基因内部含有一个EcoRI酶切位点，我们通过PCR法诱变又形成一个EcoRI酶切位点，可以通过EcoRI单酶切验证突变是否成功。具体设计如下:仪器、试剂及药品配方：1. 仪器：PCR仪，电泳槽，水浴锅，凝胶成像仪，离心机，振荡培养箱，温箱，超净工作台，冰箱2. 试剂及配方:2.1试剂：DNA回收试剂盒，限制性内切酶（BamHI, EcoRI，XhoI）, T4连接酶，DNA电泳 marker2.2 PCR 反应体系:primex12.5卩1模板1卩1上游引物（5yM）2卩1下游引物（5yM）2卩1水7.5卩12.3 prime
3、x 配制:primexTaq酶0.125卩110xTaq 酶 buffer2.5卩1dNTP (2.5yM)2卩1水7.875卩12.4 DNA 电泳 buffer (TAE)：工作液（lx）储存液（50x）40mM Tris-乙酸242g Tris/57.1ml 冰乙酸蛋白胨10g酵母抽提物5gNaCl5g2.6 LB固体培养基（100ml）蛋白胨1g酵母抽提物0.5gNaCl0.5g琼脂粉1g3.实验方法：3.1 PCR 制备突变体片段:3.1.1第一轮PCR反应体系：反应I反应IIprimexprimex12.5卩12.5卩1模板模板1卩1卩1引物1 (5yM)引物3(5yM)2卩1卩1
4、引物2 (5yM)引物4(5yM)2卩1卩125 LB液体培养基（1000ml）水水794 C1min94 C30S55C1min30 循环72 C30S72 C5min.5卩1.5卩11 mM EDTA100ml 0.5M EDTA(pH8.0)反应条件：3.1.2第二轮PCR反应体系:primex12.5卩1产物I2亠3卩1产物 II3卩1引物1 (5yM)2卩1引物4 (5gM)2卩1水补足至25卩1 注：弓I物1/引物4在PCR反应进行8个循环后加入。 反应条件：94 C1min94C30S35循环（第8个55C1min循环后暂停加入72 C30S引物）72 C5min3.2 凝胶回收
5、：a. 配制琼脂糖凝胶；b. DNA 琼脂糖凝胶电泳；c. 紫外灯下截取相应的DNA片段凝胶，置于1.5ml dorf管内；d. 每管加入500卩1溶液A，55C水浴融化10min,其间可振荡助融2-3次；e. 融化后，每管加入15卩1溶液B,混匀，加入离心柱；f. 离心 12000rpm， 30s；g. 弃下管液，每管加入500卩1溶液C,离心12000rpm, 30s；h. 重复步骤g （弃下管液，每管加入500卩1溶液C,离心12000rpm， 30s）i. 弃下管液，离心 12000rpm， 30s；j. 将离心柱置于新的dorf管中，室温敞开离心管盖2-3min,每管加入25卩1溶液
6、D,室温 放置 2min；k. 离心 12000rpm， 1min。3.3 酶切体系：3.3.1 构建质粒酶切体系：酶切片段酶切载体片段0卩1pcDNA3.1 质粒0卩1BamHI.5卩1BamHI.5卩1XhoI.5卩1XhoI.5卩110xK10xK卩1卩1水水1卩19卩13.3.2 酶切验证体系：酶切体系I酶切体系II质粒1质粒11.5卩11.5卩1BamHI0.XhoI25卩10.EcoRI0.25卩125卩110xKl1卩10xH1卩1水补水补足至101足至1013.4 连接体系：载体（100ng）卩1片段（ 68ng）卩1T4 连接酶0.5卩110xbuffer1卩1水补足至10卩
7、13.5 制备感受态：a. 取培养的菌液lml转至100ml LB液体培养基，菌体振荡培养至OD600=O.35（可凭经验）;600b. 将100ml菌液转至两个冰预冷的灭过菌的50ml离心管内，冰浴10ml；c. 离心，4C 4000rpm, 10min；d. 弃上清，每管加入10ml冰预冷的灭过菌的0.1mol/L CaCl2，重悬沉淀；e. 离心， 4C 4000rpm， 10min；f. 弃上清，每管加入2ml冰预冷的灭过菌的0.1mol/L CaCl2，重悬沉淀，再分别加入2ml 灭过菌的 40甘油，混合均匀；g. 按每管150卩1分装，-80C贮存备用。3.6 转化：a. 超净工作
8、台内，将连接体质粒加入感受态细胞，冰浴30min；b. 热击， 42C， 90 秒；c. 冰浴12min；d. 超净工作台内，加入800卩1 LB液体培养基，振荡预培养50min；e. 离心，8000 rpm， 1.5min,弃上清，余100卩1左右，吹散沉淀；f. 涂布LB固体培养基平板，37C正置培养1h；g. 翻转平板倒置培养过夜。3.7 小提质粒：a. 离心收集菌体，12000rpm, 30S；b. 弃上清，150卩1 溶液 I (25mM Tris-Cl, 10mM EDTA)重悬菌体；c. 加入150卩1溶液II (2%SDS： 0.4M NaOH = 1： 1)轻混；注：溶液II
9、现用现配。d. 加入150卩1溶液III轻混；乙酸钾( 5M)60ml冰乙酸11.5ml水28.5mle. 离心， 12000rpm， 5min；f. 收集上清至新管，加入等体积酚：氯仿(1： 1)，振荡；g. 离心， 12000rpm， 5min；h. 移上清至新管，二倍体积无水乙醇沉淀 20min；i. 离心， 12000rpm， 10min；j. 弃上清，室温干燥，20卩1 TER溶解；k. 电泳验证。日程安排：第一组第二组周六1. 第一轮 PCR；2. 分别将反应I与反应II的产物进 行2%琼脂糖凝胶电泳，根据凝胶 回收试剂盒说明书分别回收得到 产物 I(446bp)与产物 II(31
10、4bp)。3. 通过2%电泳验证回收效率(上样 量：2卩1)。4. 第二轮 PCR；5. 电泳回收(产物736bp)及验证。周日晚：6： 008： 00酶切载体及片段1. 第一轮 PCR；2. 分别将反应I与反应II的产物进 行2%琼脂糖凝胶电泳，根据凝胶 回收试剂盒说明书分别回收得到 产物 I (446bp)与产物 II (314bp)。3. 通过2%电泳验证回收效率（上样 量：2卩1）。4. 第二轮 PCR；5. 电泳回收（产物736bp）及验证。6. 酶切载体及片段周9： 4012： 001. 回收载体：1 %琼脂糖凝胶电泳，切取 相应大小片段，应用试剂盒回收载体 DNA。2. 回收片段
11、：二倍体积无水乙醇加1/9体 积小提溶液III （醋酸钾），沉淀20min， 离心，12000rpm, 10min；弃上清，室 温干燥，1520卩1 TE溶解。3. 电泳验证19： 1020： 30连接15： 1017： 001. 回收载体：1 %琼脂糖凝胶电泳， 切取相应大小片段，应用试剂盒 回收载体DNA。2. 回收片段：二倍体积无水乙醇加 1/9体积小提溶液III （醋酸钾）， 沉淀 20min,离心，12000rpm， 10m in；弃上清，室温干燥，15 20卩1 TE溶解。3. 电泳验证。周17： 3021： 3017： 3021： 30一转化连接周17： 3019： 3017：
12、3021： 30三挑菌转化周17： 3019： 3017： 3019： 30四小提质粒挑菌周五15： 1021： 301. 电泳小提质粒样品；2. 酶切质粒。15： 1021： 304. 小提质粒及电泳验证；5. 酶切质粒周8： 0014： 00六电泳验证电泳验证实验结果及讨论：图 2 ：产物 II 电泳2000bplOOObpf750bpf500bp250bplOObpf2000bplOOObpf750bpf500bp250bplOObpf图 3 ：产物 I 电泳回收图 4 ：产物 II 电泳回收2000bpl000bp750bp500bp250bpl00bp736bp2000bplOOOb
13、pf750bpf500bp250bplOObpf736bp图 6 ：全长突变片段电泳回收图 5 ：全长突变片段电泳图 7 ：载体酶切电泳5427bp2000bplOOObpf750bpf500bp250bplOObpf*-736bp图 8 ：片段醇沉回收图 9 ：载体酶切电泳回收2000bplOOObpf750bpf500bp250bplOObpf5427bp*-736bp图 l0：BamHI/XhoI 双酶切验证2000bplOOObpf750bpf500bp250bplOObpf59l8bp245bp2000bplOOObpf750bpf500bp250bplOObpf6l63bp图 ll ： EcoRI 单酶切阳性结果图 l2：EcoRI 单酶切阴性结果注意事
