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1、细胞活率计算细胞活率就是活细胞的比例，可用台盼蓝拒染法计数活细胞：1. 加5mL培养基彻底混合细胞悬液。2. 直接用台盼蓝溶液稀释样本。例如：取20ul细胞悬液加入80ul台盼蓝溶液 中，稀释5倍。涡悬振荡，混合稀释的细胞样本。3. 血细胞计数器的准备：首先用酒精清洁其小室和盖玻片，然后用脱脂绵擦干。 仔细的将盖玻片覆盖两个小室。4. 用微量移液器吸取10ul稀释的样本充满两个小室，不要过满或不足。5. 计数4个大方格中的细胞总数（1x1x0.1mm）。死细胞染成蓝色的死细胞（因为 细胞完整性破坏而吸收台盼蓝），活细胞透明有折光（未染色）。6. 细胞密度计算方法：每个方格中活细胞总数平均值x稀
2、释倍数x104=活细胞数/mL。7. 活细胞百分比计算方法如下：活细胞数二活细胞数+死细胞数）x100% =活细胞百分比。细胞计数板使用方法实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞 的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。具体操作：1. 将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。2. 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min,注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。3. 计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算： 细 胞数/mL二四大格细胞总数/4X104o 说明：公式中除以4，因为计数
3、了4个大格的细胞数。 公式中乘以 104因为计数 板中每一个大格的体积为：1.0mm （长）X 1.0mm （宽）X0.1mm （高）=0.1mm3，而 1m1=1000mm3。（注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液）细胞计数板的使用 血球计数板-基本构造 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。中 间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格 网，每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数区。计数区 的刻度有两种：一种是计数区分为 16 个大方格（大方格
4、用三线隔开），而每个大 方格又分成 25 个小方格；另一种是一个计数区分成 25 个大方格（大方格之间用 双线分开），而每个大方格又分成 16 个小方格。但是不管计数区是哪一种构造， 它们都有一个共同特点，即计数区都由 400 个小方格组成。计数区边长为1mm，则计数区的面积为lmm2，每个小方格的面积为 l/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm,所以每个计数区的体积为 0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。使用细胞计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升 菌液中微生物细胞的数量。细胞计数板-使用方法 1视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜
5、面一般稀释100倍），以每小格的 菌数可数为度。2取洁净的细胞计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。3将菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片 的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区， 勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接 滴加在计数区上（不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成 计数区深度的升高），然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。4静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将细胞计数板放置于 显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。 由于生活细胞的折光
6、率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。 5计数 时若计数区是由16 个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下 的 4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数 上述四个大方格外，还需数中央1 个大方格的菌数（即80个小格）。为了保证计 数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应 有统一的规定。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线 不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线 和右线上的细胞按规定计入相应的格中。见下图：即本格中计数细胞为3个。6. 对于出芽的酵母菌，芽体达到母细
7、胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。 每个样品重复计数2-3次(每次数值不应相差过大，否则应重新操作)，按公式 计算出每mL (g)菌悬液所含细胞数量。7. 测数完毕，取下盖玻片，用水将细胞计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹 擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。细 胞计数板-计数公式1、16格X25格的细胞计数板计算公式：细胞数/ml=100小格内细胞个数/100X 400 X 10000 X稀释倍数1、25格X16格的细胞计数板计算公式：细胞数/ml=80小格内细胞个数/80X400 X 10000 X稀释倍数血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减
8、少误差，力求准确？血细胞计数的误差分别来源于技术误差和固有误差。其中由于操作人员采血 不顺利，器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误等因素所造成的误差 属技术误差；而由于仪器(计数板、盖片、吸管等)不够准确与精密带来的误差 称仪器误差，由于细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差属于分布误差或计 数域误差(filed error)。仪器误差和分布误差统称为固有误差或系统误差。技术 误差和仪器误差可通过规范操作、提高熟练程度和校正仪器而避免或纠正，但细 胞分布误差却难于彻底消除。因此，搞好红细胞计数的质量控制一般需采用以下 措施。(1) 所用器材均应清洁干燥，计数板、血盖片、微量吸管及刻度吸
9、管的规格应 符合要求或经过校正。计数板的鉴定：要求计数室的台面光滑、透明，划线清 晰，计数室划线面积准确。必要时采用严格校正的目镜测微计测量计数室的边长 与底面积，用微米千分尺测量计数室的深度。美国国家标准局(NBS)规定每个 大方格边长的误差应小于1%，即10.01mm，深度误差应小于2%，即0.1 土 0.002mm。若超过上述标准，应弃之不用。血盖片应具有一定的重量，平整、 光滑、无裂痕，厚薄均匀一致，可使用卡尺多点测量（至少在 9 个点），不均匀 度在 0.002mm 之内。必要时采用平面平行仪进行测量与评价，要求呈现密集平 行的直线干涉条纹。最简单的评价方法是将洁净的盖片紧贴于干燥的
10、平面玻璃 上，若能吸附一定的时间不脱落，落下时呈弧线形旋转，表示盖片平整、厚薄均 匀。同时，合格的盖片放置在计数室表面后，与支持柱紧密接触的部位可见到彩 虹。精选出的盖片与其他盖片紧密重合后，在掠射光线下观察，如见到完整平行 的彩虹条纹表示另一枚盖片质量也符合要求。目前临床实验室多采用一次性微 量采血管采集毛细血管血，除注意定点购买使用信誉较好厂家的产品外，还应对 每一批量的采血管进行抽样检查，可通过水银称重法或有色溶液比色法进行校 正，误差不应超过1%。（2）红细胞稀释液应等渗、新鲜、无杂质微粒。（3）严格操作，从消毒、采血、稀释、充池到计数都应规范，尤其应注意的是 血样稀释及充池时既要作到充分混匀，又要防止剧烈震荡为破坏红细胞。必须一 次性充满计数室，防止产生气泡，充入细胞悬液的量以不超过计数室台面与血盖 片之间的矩形边缘为宜。
