《综述大肠杆菌中重组蛋白的表达进展与挑战》由会员分享，可在线阅读，更多相关《综述大肠杆菌中重组蛋白的表达进展与挑战（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、大肠杆菌中重组蛋白的表达：进展与挑战毫无疑问,重组蛋白在微生物中的表达革新了生物化学领域。以前，纯化少量的目的蛋白需要处理几千克的动物或植物组织，或是大量的生物体液，这个时代已经一去不返了。对于每个研究者来说,如果他要开始一个项目,需要某种纯化的蛋白。他马上就会想到，怎样通过重组表达的方式获得这种蛋白。目的重组蛋白的大量表达使人们能够对其生物化学性质进行分析,将其应用于工业并发展成为商业化产品。从理论上来讲,获得重组蛋白的过程相当直接：获得目的基因,克隆到表达载体,转入表达宿主,诱导，纯化。然而,实际上，事情通常并不是这样。宿主菌生长差，包涵体的形成，蛋白无活性，甚至无法获得任何蛋白，这些都是
2、实验中会遇到的问题。在过去，有许多综述详细地介绍了这个课题。综合来说，这些论文收集了200多个例子。然而在重组蛋白表达纯化领域，一直都在进步着。因此，在本综述中,我们对本领域最近取得的进展做了评述。同时，对于那些那些对异源表达还不大熟练的研究人员,我们通过回答项目开始就需要解决的问题，提供的许多选择和方法，。这些选择和方法，在过去的几十年里，曾被成功的用来表达一系列的蛋白。问题一:选择哪种生物体作为表达宿主?整个过程的开始就是要选择宿主细胞,利用它的蛋白合成机制来获得珍贵的蛋白。宿主的选择决定了我们以后所需要的技术，包括各种分子工具,仪器或者试剂。在这些微生物体中，现有的宿主系统包括细菌,酵母
3、,flamou fugi， 和 uniclragae。他们各有优点和缺点,宿主的选择可能取决于我们要表达的蛋白。例如,如果目的蛋白需要翻译后的修饰,那么我们就要选择真核表达系统。在本篇综述里，我们主要详细介绍大肠杆菌表达系统。众所周知,利用大肠杆菌作为宿主具有很多优点。它有无可比拟的快速生长机制,在glucose-slts培养基中，以及在最优的环境条件下，它扩增一倍的时间大约是20分钟。这意味着以1/100接种的菌液在几个小时就可以生长至饱和。然而,需要注意，重组蛋白的表达可能对微生物体的造成代谢压力,导致菌体扩增大幅减慢。2.高浓度细胞培养物较容易实现。在液体培养物中，理论的浓度估计最低大约
4、是200g 细胞干重/l或者1113个活力细胞ml.然而，细菌在复合培养基中的指数生长是的它的浓度远没有达到这个值。在最简单的实验设置中（例如：37,在L培养基中生长）,细菌最高能长到101/m,还不到理论值的0.1。因此,甚至为了获得重组蛋白,我们也需要一种高浓度细胞培养的方法以促进大肠杆菌的生长。作为一个重负荷机器的有机体，由于对其生理的深入研究，这些策略不断的出现。3.用一些廉价的成分,可以很容易的配制富营养的复合培养基。4 NA的转化方便而且快捷。质粒转入大肠杆菌中甚至可以在5分钟内完成。问题二：选择哪一个质粒?目前最普遍使用的质粒是复制子,启动子,选择标记,多克隆位点组合和融合蛋白以
5、及融合蛋白切除策略多个因素组合的结果。因此,表达载体的种类是非常多的，人们常常不知道选择哪一个才好。想要做一个明智的决定，这些特征需要根据每个人的需要认真的评价。复制子基因单元如质粒能够自动的复制,都包含有复制子。复制子是由复制起点以及相关的反式作用元件。选择一个合适载体的一个重要的参考因素是它的拷贝数。拷贝数是由复制子控制的。通常人们会认为，高含量的质粒会得到更多的重组蛋白,因为细胞内存在大量的表达单位。然而,大量的质粒会造成代谢压力,减缓细菌生长,可能会是质粒变得不稳定,因此,能有效合成蛋白的生物体减少。所以，高拷贝质粒无论如何不会提高蛋白产量的。通常使用的载体,例如pET系列载体,具有M
6、B复制起点（CoE衍生,每个细胞有1-60个拷贝）,而在pU系列中存在pMB1复制起点的一个突变的类型型（50-700个拷贝每个细胞）。olE1复制起点(52个拷贝/细胞)的野生型存在于pQE载体中。这些复制起点是不兼容的，在同一个细胞内会相互竞争复制机制,所以他们不能在同一细胞内扩增。想要利用两个质粒进行双表达,可以使用带有p15A复制起点的表达系统（ACYC和pAD系列载体，1-0拷贝/细胞)。三表达可以使用pC01质粒，尽管这种情况很少。这个质粒受到复制子的严谨性控制，因此它的拷贝数很低(5拷贝/细胞)。对于某种基因或者蛋白产物过量对细胞产生有害作用这种情况，可以考虑选择具有该复制子的质
7、粒。可以选择的是,共表达载体通过克隆两个基因在同一个质粒上，可以简化双表达。共表达载体拥有两个多克隆位点，每个多克隆位点都有一个T启动子,一个lac启动子和一个核糖体结合位点。通过使用不同的兼容的共表达载体,个表达载体可以得到八种重组蛋白。启动子毫无疑问，在原核启动子研究中最主要的lac启动子。La启动子是lac操纵子最主要的元件。对此系统功能的深入了解使得ac启动子在表达载体中有了进一步的应用。乳糖可以作为诱导剂用来产生蛋白。然而,在直接代谢碳源如葡萄糖存在时,诱导可被抑制。在乳糖和葡萄糖同时存在时,由la启动子引发的表达知道所有的葡萄糖消耗之后才会可是。在这个时候（低葡萄糖)，产生了cAM
8、，促进lac启动子完全激活。这种表达的正控制称为降解物阻遏作用。相应地,在生长于lac启动子抑制性糖类的细胞中，cA的水平很低，这与ac启动子低表达速率相关。葡萄糖也破坏了乳糖的吸收，因为在葡萄糖存在的情况下,乳糖透过酶是没有活性的。为了使表达能在葡萄糖存在的情况下进行,引入了一个突变型可以降低(但不完全消除)对代谢产物调控的敏感性，lacUV5 启动子。然而,当多拷贝质粒存在时,即使没有加入诱导剂,由于l启动子阻遏蛋白只存在于单个染色体上(大约10个分子/细胞)，启动子也会不可避免的高水平表达。本底表达的控制可以通过引入一个lI基因的突变启动子,称为adQ,使LaI蛋白能表达提高十倍左右。L
9、启动子及其衍生启动子lacU5表达相当地弱,因此对于表达重组蛋白并不是十分有用。合成的杂交体结合了其他启动子和lac启动子的优点。比如，启动子包含了trp启动子的35区序列和ac启动子的-10区序列。这个启动子比lacUV5启动能力强了大约10倍。应用较多的采用lc或ta启动子启动表达的商业化质粒包括U系列（laU5启动子,temo Scientific）和ML系列载体(tac启动子，NB)采用T启动子系统的pT载体是相当受欢迎的表达载体。这不足为奇，因为目标蛋白通常会占到总细胞蛋白的0以上。在该表达系统中,目标基因克隆到一个由噬菌体T7 N聚合酶识别的启动子后面。这中高度活性的聚合酶应该由另
10、外一个质粒提供或者更多的是由编码T7RA聚合酶的前噬菌体整合到细菌基因组中,由lUV5启动子启动。因此,该系统可以由乳糖或者它的onhdrlyzbl nalg iopropy-D-1-tiglacoyranosd（ITG）诱导。本地表达可以有lcIQ控制也可以通过T溶菌酶共表达控制。T7溶菌酶结合到T7NA聚合酶上并一致T7启动子的转录起始。通过这种方式，如果少量的T7RNA聚合酶由于其基因的渗漏表达而产生，溶菌酶会有效地抑制启动子控制下的不本底表达。7溶菌酶是由一个兼容的质粒提供（pLyS或者pLys）。诱导之后,T RN酶的量超过了T7溶菌酶所能抑制的量。“自由的”T NA聚合酶可以参与重
11、组基因的转录。在T7 启动子下游插入lacO启动子，形成了杂合的T7cI启动子，构成另外一个水平的控制。所有这三种机制（由lcIQ启动子介导的ac诱导T7 NA聚合酶基因的严谨性抑制,7溶菌酶介导的7RN聚合酶的抑制和在T7启动子下游的laO启动子)构成了避免本底表达的理想的系统。渗漏表达的问题反映了lc启动子的负调控。依赖于正调控的启动子应该有更低的表达水平。BA载体的raPBAD就属于这种启动子。raC蛋白同时具有激活和抑制的作用。当不存在阿拉伯糖诱导剂的时候，raC通过与NA结合抑制抑制翻译。蛋白-DNA复合物形成一个环,有效地阻止RNA聚合酶结合到启动子上。加入了诱导剂,raC转变为激
12、活模式并启动r启动子转录。在这种方式下,阿拉伯糖是诱导所必须的。另外一个广泛使用的途径是在调控噬菌体启动子下游加入一个基因。这个强的Lambda噬菌体右侧的启动子（）起始促细胞溶解基因表达。这个启动子受到I抑制蛋白的严谨抑制,在溶原生长阶段c抑制蛋白结合到启动子上面。当因为D损坏引发宿主的S应急反应时,ecA蛋白的表达被激活，反过来催化I的自我剪切,使pL控制的基因转录。这个机制被用在包含L启动子的表达载体上面。SS应急反应（重组蛋白表达)可以通过加入萘啶酸，一种NA旋转酶抑制剂。另外一个激活启动子的方式是通过将I基因放在另外一个启动子的下游来控制I的产生。这种两阶段的控制系统已经被用于基于T
13、7启动子T7 RNA聚合酶的载体上。在pLE系列载体(Lfe Technologes）中,cI抑制基因被整合在细菌染色体中受到trp启动子的控制。在缺少trp的情况下,这个启动子通常是打开的,cI蛋白持续地产生。加入rp之后，形成了trprpR抑制因子复合物，紧密的结合到trp启动子,阻止I抑制蛋白的合成。然后在pL启动子控制下的目的蛋白的表达开始。到此为止我们讨论的所有的启动子引发的转录都是有化学信号引发的。也有一些系统是与物理信号反应的(比如温度或者pH）。L启动子是一个例子。c抑制蛋白的一个突变体（cI57）是温度敏感的，在高于37的时候不稳定的。包含I87蛋白大肠杆菌宿主菌(整合到染色
14、体中或者载体中)先生长在2-30,长到需要的浓度,然后当温度达到40蛋白表达开始诱导。这个系统的商业价值一部分在于,在发酵过程中，通常都会产热,在培养物达到高浓度的时温度上升是很容易的。另一方面，在温度低于15的时候，在冷诱导启动子cspA控制下的基因开始被诱导。这个温度适于表达一些难于表达的蛋白。pCold 系列载体以pUC118为骨架(一个PUC18的衍生物),有一个csp启动子。在最初的论文中，30多个不同来源的重组蛋白被成功表达,重组蛋白占了总表达蛋白的20-0%。然而,应该注意,在一些情况下,获得的目的蛋白并不可溶。选择性标记为了阻止不含有质粒细胞的生长,在质粒的骨架上加入了一个选择
15、性标记。在大肠杆菌系统中，抗性基因通常是为此目的而使用。氨苄抗性是由bla提供,bl基因的产物是一种周质酶,可以使-ltmring of-lcm antibiis失活。然而,当-lataae持续分泌时，抗生素开始降解，在几个小时之后,氨苄青霉素几乎消耗干净。在这种情况下,在培养过程中,没有携带质粒的细胞开始增加。尽管在实验上还没有证实，抗性基于降解的选择试剂，比如氯霉素,卡那霉素也都有这样的问题。为此，在培养过程中Tetacylie表现高度稳定的特征，因为其抗性是基于抗性细胞抗生素的活性流出。在大规模培养中,主要面临的问题是抗生素成本和抗生素的disemination。在开发无抗生素质粒系统的过程中，人们做了很多努力。这些系统以质粒依赖这个概念为基础。质粒依赖是当没有质粒的细胞不能生长或者存活所发生的一种现象。例如，可以将一个关键的基因从细菌基因组中删除，然后插入质粒中。因此，当细胞分裂后，没有质粒的细菌死亡。根据他们功能的原则，质粒依赖系统可以分为不同的亚型：1.基于毒素/抗毒素的系统。2.基于代谢的系统和启动子抑制因子滴定系统。虽然被证实这个有前景的技术成功的用于大规模发酵，基于质粒依赖的表达系统仍然没有广泛使用。亲和标签如果需要纯化可溶的有活性的重组蛋白，设计这个
