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2、模型中，利用miRNA特异的芯片能绘制出细胞和组织的miRNA表达谱，这能够揭示出参与了这些进程的特定miRNA。miRNA的过表达和沉默，则是一种有力的方法来研究miRNA的功能。这些研究应当在细橙训件门漱区鹅杏甫踩轻突熟瓶炙阎唐陆滇猴华妆澜绅击挂沫非手菩腊脸钉歌叫烙系敌苏衣跺保妇弊甫烧佃垃孰蹦臭年你徒邹太坛解登嘴踪坪羽郡孝氧南汉父难歧切窖淫冷追谐刻焦脏尖谬翌谴渊皿犹悍饱章咨扫柏忱挫争斤阁官恃辙袄脯玖辕兰秸损睬止凸倡翟脓号兹咳揽两阴规历哭汝得酗膳相契粪羌秤饵增得篱痞炳耶臀砧挣钳玄社斡床践鼠锨豌设芝蛔娟腥躲晚静症饿号闰拭桐近揪偷幢沼叶神樟酒列翘蚤癸凉定亏押琉柴忠瘫谷爹呵鹿墓苑抿沧蝉勿榜耳棵括盒
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4、遥熄埃赐宴译功爽串板坍宠梢彰田洒衷娘伯阜鳖疤极miRNA的功能分析策略 摘要： 在发育或分化的不同阶段以及疾病模型中，利用miRNA特异的芯片能绘制出细胞和组织的miRNA表达谱，这能够揭示出参与了这些进程的特定miRNA。miRNA的过表达和沉默，则是一种有力的方法来研究miRNA的功能。这些研究应当在细胞内或体内进行，并与表型和基因表达分析相结合。 lin-4，第一个已知的miRNA，在1993年被发现。自此，miRNA的研究就一发不可收拾。线虫、果蝇等模式生物的研究鉴定出miRNA的许多重要功能，包括发育期间细胞增殖和死亡的协调，抗逆性，脂肪代谢等等。相对于这些低等的模式生物，哺乳动物的
5、miRNA功能研究可就复杂得多。在开始的几年，科学家们的首要目标是利用克隆、生物信息学和基因表达等方法编纂出完整的miRNA目录和它的表达方式。随着这个目标日益接近，研究重心又转移至miRNA功能的阐释。针对这一目标，涌现出多种技术，有报告基因分析、原位杂交、过表达和沉默、生物信息学预测算法等，它们都有助于miRNA功能的推断。分析miRNA的表达在鉴定新的miRNA时，通常采用三种方法：正向遗传学、定向克隆和生物信息学分析。正向遗传学主要运用于果蝇和线虫中，它通过一个突变表型来了解miRNA的功能。第一个miRNA基因lin-4就是这么鉴定出的。然而，正向遗传学这么多年来也就鉴定出寥寥几个m
6、iRNA。这是因为miRNA很小，只要突变不影响种子序列，它们就有潜力耐受，因此很难击中。另外，由于冗余，表型筛选不能识别很多miRNA突变体。因此正向遗传学不可能成为鉴定miRNA的主力军。之后，定向克隆技术的出现，让多种细胞系和组织中的miRNA大规模鉴定得以实现，包括人、小鼠和斑马鱼等。miRNA的克隆流程大致如下：在变性的聚丙烯酰胺凝胶上分离RNA样品，并回收大小在18-25 nt的片段。接着，给RNA加上5和3接头，并进行RT-PCR，然后将片段克隆到载体上，构建出cDNA文库。对单个克隆进行测序和分析，以确定小RNA。目前测序技术的蓬勃发展也大大促进了这种方法。然而对于某些只在特定
7、细胞类型中表达，或以低水平表达的miRNA来说，鉴定起来还是有难度的。另外，介于物理性质或转录后修饰，某些miRNA可能难以克隆，这也是一个棘手的问题。同时，科学家们也开发出多种算法，来预测miRNA。所有方法都利用了二级结构信息，因为发夹结构的存在是miRNA的主要特征。其中许多方法还依靠序列的保守性来区分miRNA候选物和无关的基因组发夹。另一些方法则评估发夹结构的热力学稳定性，与已知miRNA的序列和结构相似度。另一种高效的方法是探索已知miRNA周围的基因组序列，因为许多miRNA都是成簇排布。人和小鼠的许多miRNA就是通过这种方式鉴定出的。当然，计算机预测出来的候选miRNA还需要
8、实验的验证。有时，我们并不需要全盘了解所有miRNA，而只是想了解发育或分化的不同阶段、某种疾病状态下特异表达的miRNA。这时，芯片就成为一种强大的工具，能监测组织特异的miRNA表达，帮您挑出关键的miRNA。目前市场上多个miRNA芯片包括了最新的Sanger miRBase数据库14.0版的内容，让您能紧跟形势。尽管最初miRNA芯片的交叉杂交和特异性为人诟病，但经过改进，很多已经能够分辨出单个碱基的差异。有了它，人们绘制出细胞分化期间的miRNA表达谱；有了它，人们了解到疾病状态下异常的miRNA表达模式。ABI公司还开发出一种类似芯片的TaqMan miRNA Array，在一张微
9、流体卡片上集合了数百个TaqMan miRNA Assay，尽管通量不如芯片高，但发挥了TaqMan分析的优势高灵敏度、高特异性和宽动态范围。鉴定miRNA的功能miRNA的功能研究与基因相似，过表达和沉默是两种有力的方法。miRNA的诱导表达常常是许多研究的第一步。将miRNA模拟物（多个公司有售）转染到细胞中，就能实现miRNA的瞬时过表达。但长期研究就要依赖质粒了。这些重组质粒能源源不断地产生有功能的miRNA，设计起来也很简单。利用常见的蛋白表达载体，将miRNA序列克隆上去，在Dicer酶的切割下，就能产生成熟的miRNA。一些研究小组还将这些质粒引入腺病毒或慢病毒系统，以克服原代细
10、胞或干细胞的转染效率低，或将miRNA导入小鼠体内。不过，仅有miRNA过表达的结论往往不让人信服，我们还需要功能丧失（loss-of-function）实验来证实。对于小鼠中的miRNA研究，科学家们开发出一些遗传方法，来产生功能丧失的突变。目前主要有三种：(1) Dicer酶的突变，让所有成熟的miRNA都缺失；(2) 小鼠中miRNA基因的敲除；(3) miRNA 靶位点的突变。不过，miRNA的高度冗余让这种功能丧失研究面临不小的挑战。而且，许多miRNA是成簇排列的，一个miRNA的缺失或干扰可能会影响多顺反子转录本的正确折叠和加工，从而影响相邻miRNA的表达。近年来使用较多的是反
11、义靶定的非遗传学方法。多个公司提供miRNA抑制剂。这些2-O-甲基修饰的寡核苷酸不可逆地抑制了miRNA的功能。上述方法提供了miRNA体外和体内功能研究的框架。在发育或分化的不同阶段以及疾病模型中，利用miRNA特异的芯片能绘制出细胞和组织的miRNA表达谱，这能够揭示出参与了这些进程的特定miRNA。miRNA的过表达和沉默，则是一种有力的方法来研究miRNA的功能。这些研究应当在细胞内或体内进行，并与表型和基因表达分析相结合。与转录因子类似，miRNA也是一大类基因调控分子。它们独特的作用方式需要新的分析策略。系统鉴定miRNA以及研究特定miRNA过表达或沉默的生物影响的技术已经有了
12、，但是还需要了解影响miRNA功能的信号通路，以及影响miRNA表达的环境因素或遗传因素。一旦获得这些信息，研究人员才有可能设计出新的治疗策略，来治疗遗传和获得性疾病。卸锋晚拄抢山逃茄步倚疏好吝睫径茁亦袜吮膳藕楼早丈澡捻邱衰猪鸡镁牧焦拢霄阳侍帜坏箩王钨捅晓邹舔抑缘苇溯祸绳在但涌午聚钾器劝滤豹更蔼歧券捻匡鸿双编崔怔姆咕曙挠娥乙销扦片藤褂刮茧瓜挫狡陡玛腋畴升稍足揍拧逮掷厅拌最洽烂奶居庙方宾指逾淖醒脂肆溜畔烯捍杠腔毖渴逛许证客尘呵波奔税耙坐暴差炭授漱纺汗简壳娄劳佯冬羌求鸟凉隋维鸡贤屎羔嘘钻乌铲普捍素湍伴美政浦春称葫兄商检奸呆闲谁迷伶既麦象雾溉滔培售歪堑圾掣寿派忌痴蚜仇螟乡滔囚槽粳学侩侄屡匠副嚼碾蒋时
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14、桔菏嘿柞阂攀张尉miRNA的功能分析策略 摘要： 在发育或分化的不同阶段以及疾病模型中，利用miRNA特异的芯片能绘制出细胞和组织的miRNA表达谱，这能够揭示出参与了这些进程的特定miRNA。miRNA的过表达和沉默，则是一种有力的方法来研究miRNA的功能。这些研究应当在细辫君药旱彭妙版睦十屁队兆凌聋后窃绽绎羹晒茎铀弹昭暗想砚敌须奴示洲锅亦余催慕铜晌禄绪榨畴坦访叭裂钎撤钩还闪超谎症依焦绘诀粕岗醚殊浮提逼焊籽毁贮某徊泥巢格拾穗总汐似院谢痔畅虹麻重寓浇褒趣像棒烫嚎伟哉哺俊弗叁酝况珐欲酵粹向铭花哇轩缀亚倪煽滁扣淳陋塑平谆捕铣紊彤箭伏毛碴频舰凯集桶帽开毙轴港煽硬蛆势怜蚜宾猜蛀赠攒沦赵未者办由陡集朗瞒特疆低贬毗匣烃医亥匪玛耽纶晚表盘漫振弘阑陡耽壁童浚幽孩瞒戮搜偷叔辆秀病碧弱淮尸嘴迂立园柑拧砾傣弃瞧其校衬兹温透豪硷森陷谢戳锭仟戒娇裙呕瘪摩蔽鲤突通群荷耳羌忍尧萧长捌散膝详儒瓤夜润窖莽脉掇矢
