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1、淋巴细胞亚群测定（CD系列）方法流式细胞仪（BeckmanCoulter，贝克曼库尔特）原理：双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白 细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞 仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+ B淋巴细胞：CD5+ CDI9+;辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+ 抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+ NK细胞：CD3-CDI6+56+等。根据淋巴细胞膜 上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群， 利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。
2、标本采集与处理受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血要求 1 .样本量至少1ml。2 .样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。3 样本白细胞计数应在 4.0-10.0 X 109/L之间。若10.0 X 109/L,样本需要稀释，用PBSffi释；若4.0 X 109/L，应分离单个核 细胞。4 .溶血样本不能用。试剂品牌贝克曼库尔特剂型规格贮存成分1 :单克隆抗体液体1ML2 8C2:全血溶血试剂液体A:甲酸液体70ML室温B:碳酸钠等液体32ML室温C:多聚甲醛液体14ML室温3鞘液液体20L室温4清洗液液体5L室温5荧
3、光微球液体10ML2-8C质控品BEKAMANCOULTER品,未开瓶的试剂于2-8 C保存，可在有效期内保 持稳定，稀释的试剂于2-8 C可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情 况随时进行校准。仪器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入 20 ul单克隆抗体和同型对照2）分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟4）溶血：a. OptiLyse C（按说明书步骤溶血）b. 使用COULTERPREP制备系统开机-显示READYT亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管 关门-自动
4、进行溶血-显示READY丁亮-开门-取出试管 -再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5）上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）报告结果报告百分数（和绝对值）操作性能精密度批内五次重复CV%灵敏度 500 1000个荧光素分子参考值（百分数（绝对值）CD3+ 60.8-75.4%（1141-1880） CD4+ 29.4-45.8%（478-1072）CD8+ 18.2-32.8%（393-742）NK 9.5-23.5% （175-567）Th/Ts 1.05-2.03临床意义1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免
5、疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具 有临床诊断、病情判断、治疗等价值。临床常用Th/ Ts比值来判断病人的免疫状况。Th/Ts比值升高：表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg乙肝等。Th/Ts比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝 和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。2： NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK细胞增加。*(8ood )板
