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1、2016-2017学年上学期植物生理学实验科技论文题目 小麦种子发芽率的测定及干旱胁迫 对小麦部分生理生化指标的影响姓名王晓云 学号1443204000306院、系 生命科学院学院专业 应用生物科学2016年12月29日小麦种子发芽率的测定及干旱胁迫对小麦部分生理生化指标的影响 王晓云，云南师范大学生命科学学院，14应用生物科学班，1443204000306摘要：本论文主要研究了干旱胁迫对小麦以下生理生化指标：脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、抗氧化酶(PPO、POD)、谷胱甘肽(GSH)的含量的影响。本实验选用小麦种子及其幼苗作为实验材料，用快速测定方法测定小麦种子的
2、发芽率，同时在实验过程中设立对照组和实验组测定小麦幼苗干旱胁迫生理生化指标并对其抗旱性进行评估。 所有干旱胁迫下植物细胞内生理生化指标的含量都采用分光光度计测定；根据对照组和实验组所得的数据分析后表明干旱对小麦的生理生化指标的含量都有一定的影响，经干旱胁迫后小麦中Pro、MDA、H2O2、PPO、POD、GSH的含量相比正常生长条件下的小麦含量都呈现上升的趋势。总体而言，受干旱胁迫的小麦的抗旱性强于普通生长的小麦。关键词：小麦、干旱胁迫、Pro、MDA、H2O2、PPO、GSH、WSS、POD引言：植物生活的环境不是恒定不变的，我国幅员辽阔，地形复杂，气候多变，植物的抗逆性机理与农林业生产关系
3、密切。对植物产生伤害的环境称为逆境，又叫胁迫。胁迫包括生物胁迫和非生物胁迫。生物胁迫（biotic stress）有病害，虫害和杂草；非生物胁迫（abiotic stress）包括寒冷，高温，干旱，盐渍，水涝等。1小麦是我国北方地区的主要粮食作物，但是近几年随着气候的变化，小麦产量安全问题日益突出。植物最常遭受的有害影响就是缺水，即干旱胁迫。干旱胁迫后，SOD、POD和CAT等组成的保护酶系在清除活性氧、保持细胞膜稳定性方面起着重要的作用。植物体内游离脯氨酸和可溶性蛋白可作为胞质渗压剂也对低温胁迫下的植物细胞起保护作用。3本试验进一步证实了前人研究的结果，同时发现干旱胁迫对细胞膜透性的影响较少
4、。可见干旱对小麦的生理、生化都产生重要的影响，进而影响小麦的生长发育、产量和品质。因此，为了减小环境对小麦生产的影响，有必要从小麦的各项生理生化指标含量的变化，来研究干旱胁迫对小麦的影响，从而找到合适的方法来解决干旱胁迫问题，解决小麦生产安全问题提供理论依据。1.材料与方法1.1实验材料小麦种子及小麦幼苗1.2实验材料的选取和培养小麦种子预先在25的培养箱里于蒸馏水中吸胀12h。随机取60粒吸胀的小麦种子，用刀片沿胚的中线切成两半（严格区分两个半粒），一半放入一只烧杯中，另一半放入领一只烧杯中进行下列实验： 其中30个半粒进行TTC染色（30水浴 20 min） 另30个半粒进行曙红染色（室温
5、染色10 min）洗净后观察TTC染色组直接观察胚的着色情况，而红墨水染色组需用自来水漂洗种子至洗液无色为止，然后再观察胚的着色情况取经上述发芽率快速测定的同一批次的小麦种子，以0.1% HgCl2消毒10 min后，漂洗干净，于26下吸胀12 h，播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘中，每盘200 300粒，于26下黑暗中萌发2.53天。选取长势一致的小麦幼苗待用。31.3干旱胁迫处理 把上述小麦幼苗分成实验组和对照组， 将实验组用PEG溶液浇灌处理； 对照组小麦苗仍然用蒸馏水浇灌继续培养。 处理结束后， 把小麦幼苗转移到26下恢复培养7天， 每天光照12h， 观察对比实验组和对照组小麦苗生长差
6、异变化情况。 1.4测定抗逆指标含量（按照李忠光老师上课时在PPT上展示的操作方法进行实验。）1.4.1测定抗逆指标脯氨酸（Pro）的含量 Pro的提取：分别取0.1 g实验组和对照组的小麦幼苗，加入3 mL 3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂，充分研磨后用2 mL 3% SSA冲洗研钵，用离心机5000 rpm离心10 min，取其上清液并记录体积。 测定：取上清液各2 mL，分别加入2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮试剂，水浴煮沸15 min， 冷却后再5000 rpm离心10 min（若没沉淀可略此步骤）， 分别测定A520。（运用紫外分光光度法测定。） Pro content = (mm
7、ol.g-1FW)1.4.2测定抗逆指标可溶性糖和丙二醛（MDA）的含量提取：分别取0.1 g实验组和对照组小麦幼苗，加入3 mL 10%TCA和少许石英砂充分研磨后用2 mL 10%TCA洗研钵，5000 rpm离心10 min， 取其上清液并记录体积。 测定： 分别取上清液各2mL，加入0.5%TBA（用10%TCA配制）3mL， 水浴煮沸15 min，冷却后用离心机5000 rpm离心5 min （视沉淀有无），分别测定OD450和OD532。（运用紫外分光光度法测定。） OD450=C185.4 OD532=C17.4+15500C2求解方程得： C1/(mmol/L)=11.71OD
8、450C2/(umol/L)=6.45OD532 - 0.56OD450公式中C1为可溶性糖的浓度； C2为MDA浓度。 1.4.3测定抗逆指标H2O2的含量H2O2提取：分别取0.1 g实验组和对照组小麦幼苗，加入3mL 0.3%三氯乙酸(TCA)和少许石英砂，充分研磨后用2mLTCA 洗研钵，用离心机5000 rpm离心10 mi，取其上清液并记录体积。 测定：分别取上清液各4mL， 加入0.1%Ti(SO4)2 用20%(v/v) H2SO4配制 0.2mL， 摇匀， 用离心机 5000 rpm离心10 min ， 测定OD410。（H2O2） H2O2 content = (mmol.
9、g-1FW)1.4.4测定抗逆指标抗氧化酶(POD)的含量抗氧化酶的提取： 分别取对照组和实验组小麦幼苗0.1 g作为实验材料，加入少许石英砂和3 ml提取液（50mmol/L PBS, pH6.0,内含0.1mmol/ LEDTA, 1%PVP）， 充分研磨后完全转入离心管中，再用2 ml提取液洗研钵，5000 rpm离心10 min ， 记录上清液体积，用于测定POD和PPO酶活性。 POD测定：取POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解）2.95 ml，加入酶液50 ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应0.5和1.5min时的
10、A470。PPO测定：取PPO反应混合液（20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）2.9 ml，加入酶液0.1 ml（空白调零用提取液取代），立即记时，摇匀，读出反应0.5和1.5min时的A410。以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位（U）， 则： POD activities = (mmol.g-1FWmin-1)PPO activities = (U.g-1FW)1.3.5测定抗逆指标GSH的含量GSH的提取：分别取0.1 g实验组和对照组的小麦幼苗，加入3mL 5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂，充分研磨后用2mL 5% TCA洗研钵，5000 rpm离心10 mi
11、n ，上清液并记录体积。 测定：上清液各1mL (空白用3%三氯乙酸代替)，分别加入0.4mlM NAOH、1mL 2mM DTNB，然后于25 下5 min，测定A412。GSH content = (mmol.g-1FW)22.实验结果及分析对小麦种子发芽率及经干旱胁迫后小麦中Pro、MDA、H2O2、PPO、POD、GSH的含量的测定，与正常生长的小麦做比较，得出干旱胁迫对小麦部分生理生化指标的影响。计算分析中需要用到的各项指标单位：Pro含量单位：umol.g-1FW；可溶性糖含量单位：mmol/L; 丙二醛含量单位： umol/L。H2O2含量单位： umol.g-1FW； POD活
12、性单位： mol.g-1FWmin-1；PPO 活性单位： U.g-1FW； GSH含量单位： umol.g-1FW； 2.1.小麦种子发芽率测定2.1.1.小麦种子发芽率的测定结果和计算随机抽取六十粒种子，对半切开，每组染色60半粒。TTC染色：具有生命活力的有60半粒（胚红色，胚乳颜色较浅甚至发白）；曙红染色：具有生命活力51半粒（胚乳没被染红），不具生命力的9半粒（胚乳和胚一起被染红）。表一 TTC染色和曙红染色测定小麦发芽率结果 活性小麦（半粒） *发芽率 TTC染色 60 100曙红染色 51 85 注： *占计数种子的百分比。 2.1.2.小麦种子发芽率结果分析 从表一实验数据可以
13、看出，用TTC染色测定的小麦发芽率要比用曙红染色的发芽率高。但是在实验中我们是将同一颗种子分成两半，应该不存在发芽率的差异。可能是在实验过程中，由于曙红染色的个体较难分辨而产生结果的误差。两组种子的发芽率都超过了85，说明这一批种子的生命活力较高。在实验中，TTC染色中胚被染红和胚乳颜色有一定的差异，而这个差异比较明显。TTC（2,3,5氯化三苯基四氮唑）是脂溶性光敏感复合物,1894年首次合成用来检测种子的生存能力,1958年开始用来染色检测哺乳动物组织的缺血梗塞。它是呼吸链中吡啶核苷结构酶系统的质子受体,与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色,而缺血组织内脱氢酶活性下降,不能反应,故不会产生变化
14、呈苍白。 曙红染色液进行染色时小麦种子胚乳被染红是死种子的标志。因为胚乳上也有胚乳细胞，每一种活细胞膜都具有一定的选择透过性不易把外界的放进来，但是如果小麦种子失去了活力胚乳细胞死亡，则其细胞膜失去选择透过性胚乳就会被染红。2.2干旱胁迫对小麦幼苗脯氨酸（pro）含量的影响2.2.1.干旱胁迫对小麦幼苗Pro含量测定结果现象：提取液经过离心以后会变红，无沉淀产生。实验结果和数据处理： 表二 小麦幼苗脯氨酸（pro）含量 OD520 pro含量 实验组 2.892 0.089对照组 0.049 0.002 2.2.2干旱胁迫小麦幼苗Pro含量变化的影响的分析实验中经离心后变红，无沉淀产生，可能是因为在本次试验脯
