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1、综合性实验报告实验名称：小型发酵罐的使用与发酵 过程中主要生化指标测定 实验性质：综合性实验 所属课程名称：发酵工程工艺原理 班级：学号： 姓名：实验指导教师：小型发酵罐的使用与发酵过程中主要生化指标测定摘要为研究小型发酵罐分批培养过程中大肠杆菌的菌体生长状况，本实验以分批 培养法培养大肠杆菌，通过控制发酵过程的温度、溶氧、搅拌速度、空气流量、 泡沫水平等参数，并每小时取样测OD值和还原糖量，制作菌体生长曲线，以此 判断大肠杆菌的生长发酵状况。结果表明大肠杆菌在发酵的前三个小时处于生长 延迟期，发酵36小时为对数生长期，发酵6小时后该菌开始进入平衡期，第 8 小时时结束发酵实验。关键词：发酵、
2、大肠杆菌、菌体生长曲线前言大肠杆菌在生物技术中的应用十分广泛，大肠杆菌作为外源基因表达 的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济 , 倍受遗传工程专家的重视。发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。生产上使用的发酵罐容积大，均用钢板 或不锈钢板制成；供实验室使用的小型发酵罐，其容积可从约1L至数百升或稍 大些。一般来说，5L以下是用耐压玻璃制作罐体，10L以上用不锈钢板或钢板 制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试验所需要的培养 条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备1。在当今市场上，各厂家生产的发酵罐会有所差别，但基本原理是相同的，基 本
3、结构是类似的。本实验使用的是BI0TECH-7BGZ发酵罐，其结构主要又罐体 和控制器两大部分组成，罐体为一硬质玻璃圆筒，底和顶两端用不锈钢板及橡胶 垫圈密封构成，容积为5L，顶盖上有多个孔口，分别是加料及接种口补料口、 放置DO （溶解氧）电极口、放置pH电极口、放置消泡电极口、放置取样管口 等2；本罐可配置不同性能的控制器，控制器能完成最基本的功能，它由下列几 部分构成： 参数输入及显示装置，用以输入控制发酵条件的各种参数及显示发酵过程中 罐内培养液的温度，pH、DO （溶氧）的测定数值。 碱泵和酸泵分别用以向发酵罐加入碱液和酸液以调节培养液中的 pH； 消泡剂加入泵用以向发酵罐加入消泡剂
4、，以消除发酵过程中产生过多的泡沫。 自动或人工控制按钮用以决定本控制器是处在自动控制或人工控制状态。 电极连接导线：有三条连接导线，分别与pH、DO和AF （消泡）电极连接。1材料与方法1.1 实验材料1.1.1 菌种大肠杆菌（E.coil）1.1.2 培养基配方种子培养基：葡萄糖l.Og，蛋白胨l.Og，酵母膏0.5g，牛肉膏l.Og，氯化钠 0.5g，水 lOOOmL, pH7.0。发酵培养基：葡萄糖20g,蛋白胨10g,酵母膏5g，牛肉膏10g,氯化钠5g， 氯化铵 5g,水 lOOOmL, pH7.0。1.1.3 仪器设备BIOTECH-7BGZ发酵罐一套（配套蠕动泵、pH电极、溶氧D
5、O电极、空压 机及所有连接管）、分光光度计、旋转式摇床、离心机、冷藏箱、滴点装置、电 子天平、电磁炉等。1.1.4 用具 烧杯、三角瓶、量筒、保鲜膜、玻璃棒、比色杯、试管、离心管、移液管、 波珠等。1.1.5 试剂泡敌、婓林试剂、O.l%标准葡萄糖溶液、40%氢氧化钠等。1.2 实验方法实验流程：培养 24h培养 l2h培养 l0h菌种一斜面一级种子二级种子37C （250mL 摇瓶）37C （500mL 摇瓶）37C培养基 I*8 10h发酵罐管路准备一实罐灭菌一发酵放罐37CI 取样一分析测定1.2.1 菌种准备1.2.1.1 配制种子培养基 配制种子固体培养基l00mL，分装试管，0.l
6、MPa（l21C ）灭菌20min,然后 摆成斜面。 配制种子培养液500mL,各分装50mL于两个250mL三角瓶中（作一级种子 瓶），余下的培养液装进三个500mL的三角瓶中（作二级种子瓶）,0.1MPa（121C） 灭菌 20min。1.2.1.2 接种与培养 上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜面，37C培养24h。上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子瓶，37C振荡（125r/min）培养12h, 然后转接二级种子瓶，37C振荡（125r/min）培养10h。1.2.2 上罐前的准备及实罐灭菌 洗净发酵罐及各联接胶管。配制发酵培养基4000ml，置发酵罐内，视情况加入几滴泡敌。 安装好发酵
7、罐，把取样管、电极插口、补料口、消泡剂料瓶等固定、密封好 后，开夹套溢流口 V2、进水阀W1,使夹套充满水。 用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀 V4， 启动蒸汽发生器，启动搅拌马达，调转速300r/min,开启冷凝水出水阀V1,开 进水阀门S1，进行在位灭菌。将灭菌温度设为115C，保温时间0.33h，设为自动。当达到795s时，灭菌 温度达到 121C。 灭菌结束后，不打开保护罩，使发酵罐自然冷却至室温。 用 75%酒精消毒 pH 电极和 DO 电极，接入发酵罐，连接各电极导线。 流加碱的管线与泵和罐体连接，通过面板操作开关选择碱泵，打开手动开关， 使胶管内充
8、满液体，将输出上限设为15%，下限设为0，待一切准备就绪，将“手 动”开关调节到“自动”状态。设定搅拌转速为300r/min，空气流量23L/min、pH7.0、DO100%，系统进入 发酵状态。1.2.3 发酵操作 当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后，取样（用于接种前培养基成分分 析）：松开弹簧夹J2,用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧J2,将出 料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入接料瓶，开J2、J3排出 取样管内残料，夹紧J2、J3。 接种：将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口，点燃酒精棉，在火焰保护下， 打开接种口，倒入二级种子，然后旋紧接种盖，移取火焰圈。接种后
9、立即进行第 一次取样，用于测定细菌OD值。1.2.4 发酵管理控制发酵过程的各项参数（温度、PH、溶解氧、搅拌速度、空气流量、泡沫 水平等），如参数出现异常现象，则应及时排除。 每小时取一次样，每次取样50ml。取样时先将空气流量计旋钮调至01L/min, 松开弹簧夹J2,用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧J2,将出料管 放入接料瓶，松开取样管弹簧夹J3,发酵液被压入量筒，当达到40mL,开J2 排出取样管内残料，夹紧J3、J2。将样液入标记有取样时间的三角瓶，用保鲜膜 封口，立即入冰箱冷藏，取完样要及时清洗量筒。每次取样前（每隔1小时）记录发酵过程温度、PH值、DO、通风、转速的测
10、定数值，并记录操作情况。1.2.5 发酵过程中各生化指标的测定1.2.5.1测定OD值 大肠杆菌标准曲线的绘制：取10mL离心管，与105C烘2h至恒重，用镊子 夹取入干燥器，待冷却后于分析天平上称重（W0）,精确到小数后4位，然后准 确取10mL发酵液，于3000rpm离心10min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤沉淀， 同上离心，弃上清液，与100C烘至恒重，用镊子夹取如干燥器中冷却，于分析 天平上称重（W1）,精确至小数后4位，得细胞干重为W1-W0。取同一发酵液， 稀释2、5、10、20、50倍，于600nm下测OD值。以0D值为纵坐标，菌液浓度 （g/L）为横坐标，绘制标准曲线。均匀取样品
11、5mL于编号试管中，用空白发酵液稀释至一定浓度，在721分光 光度计上测定a600根据菌体浓度与吸光度之间关系地标准曲线换算出菌体浓 度。 其余发酵液于3C，2000r/min条件下离心分离8min,上清液装入编号三角瓶, 用于测糖。1.2.5.2 测定葡萄糖 样品处理：用蒸馏水对样品液进行稀释待用。 标定碱性酒石酸铜溶液：分别吸取 5.0mL 碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于 150mL锥形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠2粒，混匀，从滴定管滴加约9mL 葡萄糖标准溶液，控制在2min内加热至沸腾，趁沸以每2秒1滴的速度继续滴 加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的
12、 总体积，同时平行操作三份，取其平均值，计算每10mL （甲、乙液各5mL）碱 性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量（mg）。 样品溶液预标定：分别吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于150mL锥 形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠2粒，混匀，控制在2min内加热至沸腾，趁 沸以先快后慢的速度，从滴定管滴加样品溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜 色变浅时，以每两秒1滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液 消耗体积。 样品溶液测定：分别吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于150mL锥形 瓶中，加水10mL，加入玻璃珠2粒，混匀，从滴定管滴加比预滴定体积少1mL 的样品溶液，使在
13、2min内加热至沸腾，趁沸继续以每两秒1滴的速度继续滴加 葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积，同法平行 操作 3 份，得出平均消耗体积。 结果计算：还原糖（以匍萄糖计，g/L） =，式中：V1c 匍萄糖标准溶液的浓度， mg/mL；V 标定时消耗匍萄糖标准溶液的总体积， mL；V测定时平均消耗样品溶液体积，mL；N 被测样品稀释倍数。1.2.6 放罐 发酵8小时后，测OD值及还原糖量，当发酵液的PH不断上升且为碱性、OD 值增长缓慢，且还原糖量很低时，可判断发酵结束，准备放罐。 放罐操作同取样。将全部发酵液取出后，100C煮沸10分钟灭菌，灭完菌的 发酵液可排放入下水
14、道。1.2.7 清洗 放罐完毕后，打开自来水进水口，往发酵罐中注满水，同时开动搅拌轴搅动 清洗五分钟，排水。 再次注入自来水清洗，操作如 1。 清洗结束，关闭电源。2结果与分析2.1 实验结果2.1.1 发酵过程数据结果每小时记录发酵过程温度、PH值、DO、通风、转速的测定数值，结果如下表: 表 1 发酵过程各参数值时间发酵时间温度CpH值DO通风转速取样h%L/minr/minmL空白377.01002-33002008:300377.0109.02-3300509:30136.96.98124.12.53045010:30236.86.97115.62.53035011:30336.96.
15、9244.02.83035012:30436.96.7446.23.03035013:30537.06.7243.42.03035014:30637.06.9442.12.03035015:30736.97.3938.92.03035016:30836.98.0637.12.030350取完最后一次样品后放罐 大肠杆菌标准曲线绘制如下所示：下表2为所测菌液浓度与OD值间的关系表。表2 菌液浓度与OD值的关系表干菌体浓度（g/L）1.1600.5800.2320.1160.0580.0232测得 OD 值1.4310.7710.4810.2690.1270.043根据表2得到两者的关系曲线图1,如下图:图 1 菌液 OD 值与干菌体浓度关系图
