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1、RNA酶保护试验试剂配制、操作流程与注意事项RNA酶保护试验(RNaseProtectionAssay,RPA)是通过液相杂交的方式，用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优占：八、检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。由于PCR扩增过程中效率不均一和反应平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。1. 由于与反义RNA探针杂
2、交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。2. 步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。3. RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。4. 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。5. 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。RPA的缺点是需要同位素标记探针。1. 一、试剂准备GACUPOOL:取100mMATP、CTP、GTP各2.78p1100mMUTP0.06门力口DEPCH20至100卩。2. 杂交缓冲液：PIPES0.134g、0.5MEDTA(pH8.0)20卩、5MNaCl0.8ml
3、、甲酰胺8ml，加DEPCH2O至10ml。RNase消化液：5MNaCl12011MTris-HCl(pH7.4)20、l.5MEDTA(pH8.0)201RNaseA(10mg/ml)8、RNaseT1(250U/1)卩,1力口DEPCH2O至2ml二、操作步骤反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。设计含T7启动子的PCR引物由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5端要含T7启动子序列：T7启动子序列为：5-TAATACGACTCACTATAGGG引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同
4、。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR,即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性。PCR先用上游引物和下游引物I进行PCR,再以PCR产物为模板，用上游引物和下游引物n-T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。探针合成标记与纯化在0.5ml离心管中加入下列试剂：RNasin(40U/卩l)0.5口1GACUPOOLGAC(含GTP、CTP、ATP各2.75mM,UTP61M)2a32PUTP(10卩Ci/卩l)2.5二硫苏糖醇，0.1M)115X转录buffer2口1模板（50ng/卩I）
5、1卩1T7RNA聚合酶（15U）1卩1混合后，短暂离心，37C保温1hr。加入DNaseI（10U/卩1）1卩37C15min，然后75C10min以灭活DNAseI和T7RNA聚合酶。加入：饱和酚501氯仿501酵母tRNA（2卩g/卩I）4口1DEPCH2O100口1室温下充分混匀，离心10000gX2min。取上层液置另一0.5ml离心管中，加入100氯仿，混匀，离心10000gX2min。将上层液转移至另一0.5ml离心管中，再加入3MNaAc10卩、预冷无水乙醇250门混匀后，-20C静置30min。4C离心13500gX10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100卩洗涤，4C离心1
6、3500gX2min,弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入501杂交缓冲液溶解沉淀，4C下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。（参见本节电泳步骤）。 杂交RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1卩g/1取8卩lRNA加入1-3卩探针（根据探针检测结果调整）于0.5ml离心管中。 80C保温2min,然后40-45C下杂交12-18hr。 消化杂交管于37C保温15min，加入RNase消化液，37C保温30min。 加入10%SDS1Q1、10卩g/進白酶K20，混匀，37C保温10min。 加入65卩饱和酚和65卩氯仿，混匀，室温离心，10000gX2min。转移上层液到另一0
7、.5离心管中，加入10卩酵母tRNA和3MNaAc15卩,再加入2001异丙醇，混匀后，置-20C30min,4C离心,135000gX10min。 弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8卩上样缓冲液溶解沉淀。电泳与放射自显影配制凝胶：（50ml）40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺（19：1）6.25ml5XTBE10ml尿素24g加H2O至50ml，溶解后加入25%过硫酸胺50卩,TEMED50卩,混匀，注入电泳槽中，插入梳,待胶凝固。预电泳以1XTBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达2000v以上，功率设定为100w，温度设为50C。待胶板温度达50C时，暂
8、停电泳，准备加样。加样将已溶解在加样缓冲液中的样品80C加热2min,立即加样到胶孔中，电泳1-2hr。（电泳条件同预电泳）。电泳结束后,打开胶板,用滤纸取下胶,覆上一层保鲜膜,放置于暗盒中,暗室红光下,压上一张X片，盖上暗盒，-70C曝光1-3天。暴光结束后，将X光片显影、定影、水洗、晾干。三、注意事项1本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。2、RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA，当探针与样品之间有碱基错配时，错配位点也将被消化，因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行PCR时，采取尽量减少错配的措施。3、同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因此，标记时间不宜过长。4、RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100倍后使用。来源：生物高校，生命科学研究所
