饲料中粗蛋白质的测定

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1、饲料中粗蛋白质的测定一、目的掌握饲料中粗蛋白质的测定方法，并测定饲料中粗蛋白质的含量。二、原理饲料中纯蛋白质和非蛋白氮总称粗蛋白质。凯氏法的基本原理是用浓HS04在还原性催化剂(CuS04、KS04、 22Na SO4等)的催化作用下消化饲料样本，使其中的蛋白质和非蛋白氮都变为NH +, NH +立即被浓H SO4吸收 2442成为(NH)S04, (NH ) SO4在浓碱作用下放出NH ,通过蒸馏，氨气随水蒸汽沿冷凝管流入硼酸吸收液被硼 4 24 23酸吸收并与之结合成为四硼酸铵，然后以甲基红溴甲酚绿混合指示剂作指示剂，用标准HCL溶液滴定，求出氮含量，根据不同饲料再乘以一定的换算系数(通常

2、用6.25计算)，即为粗蛋白质的含量。上述原理的主要化学反应如下：还原性催化剂1.2CH CHNH COOH+13H SO(NH ) SO +6C0 f +12SO f +16H O322丄4 242222. (NH ) SO4+2NaOH2NH f +2H O+Na SO44 23223. H BO +NH NH H BO3334 234. NHHBO+HCLNHCL+HBO4 23433三、仪器设备1 .实验室用样品粉碎机： 40目网筛。2. 分析天平：感量0.0001。3. 电子天平:感量0. 001。4. 六联电炉：6X1000W。5. 改良式半微量凯氏定氮仪(图1 ) 。6. 酸式滴

3、定管:25ml。7. 凯氏烧瓶：100ml。8. 烧杯：250ml。9. 三角瓶：150ml。10. 容量瓶：100ml。12. 量筒: 10ml 。13. 量筒：25ml。四、试剂1. 浓HS0 :化学纯,含量为98%，无氮。242. 混合催化剂：CuSO :NaS0=1:10 化学纯。4 2 43. 甲基红溴甲酚绿混合指示剂：0.1%甲基红酒精溶液与0.5%溴甲酚绿酒精溶液等体积混合，阴凉处保存 期不超过三个月。此混合指示剂在碱性溶液中呈蓝色，中性溶液中呈灰色，强酸性溶液中呈红色。在硼酸 吸收液中呈暗紫色，在吸收氨的硼酸溶液中呈兰色。4.2%硼酸吸收液：溶2g化学纯硼酸于100ml蒸馏水中

4、，加甲基红一溴甲酚绿混合批示剂0.4ml。5.40%饱和NaOH溶液：溶40克氢氧化钠（化学纯）于100ml蒸馏水中。6.0.05mol/l的HCL标准液：取分析纯浓HCL（比重1.19）4.2ml,加蒸馏水稀释至1000ml,用基准物质标定。 将基准无水碳酸钠（分析纯）于270-300C灼烧40分钟称重，至恒重，准确称取0.013-0.015克，溶于50ml 蒸馏水中，加2滴甲基红一溴甲酚绿混合指示剂，用欲配的0.05mol/lHCL滴定至暗紫红色，记录HCL用量W Na CO （g）计算：c=五、测定步骤 样本的消化：精确称取饲料样本0.5-1g，以硫酸纸卷无损的移入消化管中，再加入5氺硫

5、酸铜0. 4克，无水硫酸钾 或硫酸钠6克，加10ml浓硫酸后将凯氏烧瓶放于通风橱的电炉子上消化（为防止消化时液体溅失，可再加 两粒玻璃珠）。注意：先低温加热（100-200C）,注意防止泡沫浮起，待泡沫消失后，提高加热温度（约360-410C） 至沸腾。消化时要经常转动凯氏烧瓶，如果有黑色炭粒不能全部消化，待烧瓶冷却后，补加少量浓硫酸后 继续消化至溶液澄明无黑点并呈蓝绿色为止，移出电炉，放于凯氏消化架上冷却。 转移：将冷却的消化液加少许蒸馏水约20ml，摇匀后无损移入100ml容量瓶，再用蒸馏水反复冲洗烧瓶 数次，直至消化液全部转入容量瓶中，冷却至室温后以蒸馏水定容至刻度。即为试样分解液。 空

6、白实验：另取凯氏烧瓶一个，加入混合催化剂（同前），浓硫酸10ml，同样消化至澄清，冷却后按上 述方法转移至容量瓶中，定容至刻度备用。式中：V1样品滴定时HCL的用量(ml)。V0空白滴定时HCL的用量(ml)。V2样品消化后定容的体积(ml)。V3蒸馏时，吸收样品消化液的体积(ml)。C标准盐酸溶液的浓度(mol/L)。W样品重(克)。6.25氮换算成蛋白质的平均系数。0.0140每ml吸收HCL相当于0.0140克氮。七、注意事项1. 消化时开始时一定要用小火，当泡沫停止产生后才能加大火力。2. 消化时间一般为4小时左右即可，时间过长会引起氮的损失，但若样品中赖氨酸或组氨酸较多时，时间 需延

7、长1-2倍。因为此二种氨基酸中的氮短时间内不易消化完全。3. 样本含脂肪或糖较多时，消化时间要延长，同时应避免产生气泡而溢出瓶外，一旦产生大量泡沫，可摇 动烧瓶并减少火焰，必要时停止加热一段时间。4. 蒸馏过程中，要严防仪器接头处漏气现象。V HCLX0.0534. 蒸馏：取35ml 2%硼酸溶液于锥形瓶中，加混合指示剂2滴，将冷凝管的末端浸入硼酸液面下，准确移 取试样分解液10-20ml,注入蒸馏反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加400g/L 氢氧化钠溶液10ml，小心的拉起玻璃塞使之进入反应室，将玻璃塞好，入口处加水封好，防止漏气，蒸馏 4分钟，式冷凝管离开液面，在蒸

8、馏1分钟，然后停止蒸馏。(说明：就蒸馏方法来看，商业部门多用半微量法，农业部门多用常量法，本书主要介绍半微量凯氏定氮 法。)1蒸馏瓶反应室5 .滴定：先将酸式滴定管准备妥当，装入0.02mol/l (0.1mol/l)的HCL标准液，然后将吸收液用HCL滴 定，至瓶中溶液由蓝绿色变成灰红色为止，记录HCL用量(ml)。空白消化液的测定与上述方法相同。六、测定结果的计算(V1-V0) X0.0140X6.25XC粗蛋白质=X100WX (V3/V2)5. 重复性：每个试样取两个平行样进行测定，结果取其平均值。7 .精密度要求：粗蛋白含量在25%以上者允许相对误差1%；粗蛋白含量在10-25%者允许相对误差2%；粗 蛋白含量在10%以下者允许相对误差3%。