多糖提取的相关操作

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1、一、DEAE 柱：1. 准备柱子：（1）洗柱：洗涤剂、自来水、去离子水，洗至不挂水珠、水不成股下流。（2）浸泡滤膜：95%酒精，浸泡柱上下滤膜（包括胶圈）至少30min,时间可延长（5h左右），主要作用是脱去脂溶性杂质。每次柱使用完毕后都要做此步骤。（3）洗布氏漏斗：用 10%HCL 抽滤，后用蒸馏水洗涤，去除滤膜板中可能灰尘。（ 4） 装柱：铁夹夹紧对齐，装完柱后要检查是否漏水。2. 准备填料：（再生步骤）（1）DM 过酸过碱： 0.2M/L HCL 和 NaOH 浸泡填料，先碱后酸，从加入碱时开始计时，一般为30min，加入时用玻棒搅动，以防与碱作用不充分。但若是新填料， 浸泡20min后

2、即可使用。碱对填料有影响，忌浸泡时间超过30min，一般20min 即可。入碱后，用去离子水（2L,充分去除OH根离子）在布氏漏斗上过滤。 脱水完全（洗2-3遍至中性）。后浸泡酸。重生方法同上。（2）脱气：先溶解DM,再倒入抽滤瓶，真空抽滤，至无白沫，可时而摇晃，抽至无白沫无气泡。重要，最好能延长脱气时间。3. 上柱：倾倒填料时浓度尽量稀，使填料贴壁下流。静止。待填料沉降，吸出上清液，统一收集， 反复此操作，尽可能回收填料。（尽量不起气泡）沉降一段时间后，待上清未完全沉降时倒 入尚未倒完的胶，防止多次倾倒引起的分层现象。此时，用夹子夹住软管，使其不漏液，待 沉降完全，出现清水层，去除夹子，滴液

3、。4. 平衡：若上柱平衡后暂时不上样，可隔一天平衡一次，防止长菌。滴数：三秒1滴， 20分钟收集一管约10ml, 33小时过柱一体积。水层不能滴干，防止胶出现干裂现象。5. 检验：用1M AgNO3检验过柱水中Cl离子是否洗净，至无Cl离子后再过一柱体积。皆用去离子水。6. 上样：上样前样品水溶，离心，先取上清，收集保留不溶物。（1）粗柱子：DEAE量占柱体积80%高度（标记高度，要有足够的塔板数），上8克样。上样步骤：先将螺旋拧开，用夹子夹紧软管，放在液面以上，使其液面不下降。取出上层流动相，使液面与填料面相切，用移液管加样，加样使尽量靠近填料，贴着柱子壁转一圈，均匀加样。加完后用流动相洗一

4、下残留在壁上的样品。松开夹子，使其滴液，待样品吸附上填料后，夹紧夹子，放在液面以上 在柱子内加入一段流动相，拧上螺旋，开始走样。(2) 流速：六秒一滴。(3) 流动相：视多糖的实际情况而定。7. 硫酸苯酚法测多糖：先确定样品出现的管数，确定头和尾后，三管一测。(1) 方法：100微升样品，400微升5%苯酚(枪头)，2ml浓硫酸(移液管)。振荡后静置 1 小时。 490nm 处测量。(2) 试剂的配置：苯酚沸水浴溶解，制备5%溶液500ml备用。8. 收集：9. 旋蒸：收集到一定量后，进行旋蒸，浓缩至10ml内。10. 透析：(1) 透析袋的准备：剪20cm左右透析袋，烧杯中沸煮5分钟后用蒸馏

5、水60C冲洗2分钟，4C待用。使用后用蒸馏水或者加0.05%-0.1%的叠氮钠的蒸馏水保存，每 次使用之前都用水清洗、沸煮。(非即用型)(2) 透析袋的选择：一般根据所得的糖的分子大小来选择透析袋，在未知的情况下使用孔径最小的透析袋(截留分子量3000)。(3) 透析：加样至透析袋的 2/3，两头用夹子夹住，纯水透析，一小时换一次水， 4至 5 次。过夜。11、再次浓缩至高度少于1cm，冻干。二、G100 柱：1、G100的准备：(1) 先确定装柱的体积，再确定装柱的质量，具体换算公式为：1克凝胶吸水10ml*10倍即100 (G100型号判定)。(2) 将胶泡在将胶泡在超纯水， 3 天，多放

6、点水，要换水去杂质。(新胶)( 3 ) 脱气。2、装柱：（1） 将胶混匀装柱，不可起泡，倒入装柱，玻棒引流。最好是边轻轻搅动边倒胶。（2） 沉降，接恒流泵，平衡流速极慢。平衡至胶的高度不变。3、流速：上样后流速50分钟 6ml。4、流动相：万分之一的NaN3，其他视实验要求而定。5、当柱子压力变大，流速自动变慢后，可倒流冲洗，流速可快一点。6、上样：llOmg左右，溶至lml,震荡漩涡器充分溶解，上样之前过滤。上样时，取出胶面上层 的清夜，将样品贴在柱子内侧成圈状加样，越靠近胶面越好，残留在柱子上的样品越少越好。 少量流动相清洗柱子壁。待样品都吸附在胶上，加上上清流动相，开始走样。7、检测方法

7、：50ul样+1ml 5%苯酚（配制苯酚时，所有容器预热）+2m 1浓硫酸，室温后测量。490nm。收集到一定量后，浓缩至10ml以内。8、透析：加样至透析袋的 2/3，纯水透析，一小时换一次水， 4 至 5 次。过夜。用最小截留分子量的透析袋。透析袋分即用型和非即用型，即用型用蒸馏水冲洗后直接使用，无需前处理。非即用根 据说明书进行前处理，比较常见的处理方法为：用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净。使用时，一端用透析夹夹紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待 透析液，通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外 的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。含盐

8、量很高的蛋白质溶液透析过夜时，体积增加50 是正常的。为了加快透析速度，除多次更换透析液外，还可使用磁子搅拌。透析的容器要大 一些，可以使用大烧杯。小量体积溶液的透析，可在袋内放玻璃棒，以使透析袋沉入液面以 下。使用时需戴手套。使用后的透析袋洗净后可存于4C蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN3,以防长菌。一旦已呈湿状即不可再完全干躁。9、再浓缩：浓缩后的量越少越好，液体的厚度不要超过lcm。10 、冻干。三、蛋白检测：考马斯亮蓝法测蛋白：1、考马斯亮蓝染色液的配制：准确称取lOOmgCBB,溶于50ml 95%乙醇溶液中，与100ml 85%磷酸（W/V）混合, 加水至1000m 1。充分

9、溶解去固体。2、标准蛋白溶液的配制：已知浓度的蛋白溶液（BSA）,用生理盐水配制成100ug/m1蛋白溶液。制成母液。3、标准曲线的测定：试管编号0123456100ug/ml 标准蛋白( ml)0.00.10.20.30.40.50.60.15mol/L NaCl (ml)10.90.80.70.60.50.4考马斯亮蓝试剂 （ ml）5555555摇匀，室温放置5min，以0号管为空白对照，在595nm处比色。制作标准曲线。4、样品的测定：四、分子量测定：HPLC 色谱仪由 Beckman Coulter System Gold 508自动进样器， Gold 126 gradient HP

10、LC 泵及 Sedex 75ELSD 检测器构成；色谱柱为 TSK-GEL G4000PW（XL）。 流动相为 XL0.003mo1/LNH4AC，流速0.5mL/min,样品溶于流动相中，浓度为0.2% （w/v）,进样量10 M L。用不同已知分子量的Dextran-T系列葡聚糖制作标准曲线，根据分子量与保留时间RT 的关系，即可算出多糖的分子量。五、GC-MS前处理：1 、判断多糖极性：取样品2mg,溶于4 mL2 mol/L TFA中，110C下封管水解1.8h，加甲醇反复减蒸发缩 至干，以完全去除TFA。水解产物溶于0.2mL水中，取5p L进行TLC分析。展开剂系统 为乙酸乙酯：吡

11、啶：冰乙酸：水=5： 5： 1： 3 （v/v），展开距离为8cm。待溶剂挥干后，用 苯胺-邻苯二甲酸试剂（将1.6g邻苯二甲酸溶于100 mL水饱和正丁醇中，加入0.9 mL苯胺。） 显色。用该试剂喷雾后，于105C加热5-10min，己糖、脱氧己糖呈黄褐色，戊糖和糖醛酸 呈粉红色。因此若样品含糖醛酸，即会出现迁移率较小（Rf约为0.1）的粉红色斑点，反之 则可确定为不含糖醛酸。2、中性多糖：TFA水解产物溶于2 mLH2O中，加入25mgNaBH4，室温下还原2h，间歇振荡，用乙 酸中和至无气泡产生，反复加甲醇减压蒸发至完全干燥。于100C下干燥15min,加入2 mL 乙酸酐（可多加些）

12、，100C反应lh。反复加甲苯减压蒸发除去乙酸酐（蒸干彻底），产物经 氯仿萃取，水洗四次，氯仿层经无水硫酸钠干燥，浓缩至50yL后进行GC-MS分析。3、Conrad 法：将15mg多糖样品溶于10mL水中，加入N-环己基-N- （2-N-甲基吗啉代乙基）-碳二亚 胺-对甲苯磺酸盐300mg，磁力搅拌下滴加O.Olmol/L的HC1,用自动电位滴定仪使pH保持 为4.75，维持2h。滴加2mol/L硼氢化钠溶液（20mL）,此时pH值急剧上升，须用4mol/L 的HC1将pH控制在7.0，持续搅拌，控制硼氢化钠溶液在45min内加完，若反应中生成大 量泡沫，可滴加几滴异戊醇消泡。加完后，在室温

13、下继续反应lh,滴加冰醋酸使pH为6.8。 然后将反应液对蒸馏水透析，内液减压浓缩至10mL，冷冻干燥。此反应通常须进行2-3次， 取少量样品经2 mol/L TFA完全水解后进行TLC分析以确定是否完全还原。4、酸性多糖：1）取一部分TFA水解产物按与中性多糖相同的方法进行处理，测定其中中性糖基的组成；2）另取一部分多糖先用Conrad法16还原，再经TLC法检测还原是否完全。完全还原后的 产物用中性多糖相同的方法进行处理，然后进行 GC-MS 分析。比较同一样品还原前后的 GC 结果，若其中某一中性糖含量明显增加，即可确定所含糖醛酸的种类及含量。步骤1） 中水解时部分释放的糖醛酸可能形成内

14、酯，经硼氢化钠还原为糖醇，从而导致GC测定时某 些中性糖含量增加，因而由此计算出的糖醛酸含量通常偏低。5、注意事项：去水蒸干时，试剂可以多加一些，蒸干时要彻底。六、甲基化：取9mg样品于反应瓶中，置于盛有五氧化二磷的干燥器中真空干燥过夜。样品溶于2mL 无水二甲亚砜（经4A分子筛干燥）中，加入粉末状氢氧化钠20mg左右，室温下搅拌10min, 后滴加碘甲烷2mL （可多加一些3ml），室温下搅拌30min，30C减压蒸发除去未反应的碘 甲烷，反应液对蒸馏水透析，内液减压浓缩（蒸不出去可加点水共沸）后冻干。此过程重复 4次后，取少量甲基化产物以五氧化二磷为干燥剂真空干燥24h,然后用石蜡膜法（N

15、ujol） 测定IR谱，以确定甲基化是否完全。完全甲基化的多糖，其IR谱中3400cm-1处的OH峰 会消失。完全甲基化的多糖用90%的甲酸（2mL）于100C加热解聚4h，减压蒸干，然后加入 2mol/L TFA（3mL）,于100C下加热水解6h,加甲醇反复减压浓缩至干，以完全出去TFA。 水解产物溶于2 mLH2O中，加入25mgNaBH4，室温下还原3h,间歇振荡，后用乙酸调pH 至5左右，加入2mL甲醇及一滴乙酸，减压蒸干，重复三次使硼氢化钠完全分解，并转化 为乙酸钠。100C下干燥10min,加入2mL乙酸酐于100C反应lh,加入甲苯反复减压蒸发 至完全干燥。所得乙酰化产物用氯仿萃取，蒸馏水洗涤4 次，氯仿层用无水硫酸钠干燥，然 后减压浓缩至O.lmL左右，进行GC-MS分析，根据相对保留时间及MS离子碎片峰鉴定各 组分甲基取代的位置。注意：碘甲烷为危险试剂，操作中小心。所有甲基化操作的试剂和仪器要干燥过夜，干 燥罐口多抹一点凡士林，保持密封。七、红外光谱分析：a、卩构象分析：取1 mg样品，KBr压片，于4000500 cm-1进行红外扫描。甲基化产 物采用石蜡膜压