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1、实验一蛋白质分子量的测定一凝胶层析法一、原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔 凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其 中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方 便、重复性好、样品回收率高。凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒 的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的 分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子 大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析 柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶 颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，
2、先被洗出层析柱；而 小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程 长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子 彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物 质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相对分子质量的蛋白 质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过 的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”以Vt表示。实质上 Vt是由Vo, Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体 积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一 般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积
3、，即凝胶颗粒内部所含水 相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积（Ve）与Vo与Vi之间 的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi。式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰） 出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以 说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被 分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长 度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。 Kd可通过实验求得，上式可以改写为:Kd=（Ve-Vo）/Vi。上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分 子物质的溶液（最好是有颜色以便于观察
4、，如血红蛋白，印度黑墨水， 分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等）通过实际测量求得；Vi可由 gXWr求得（g为干胶重量，单位为克；Wr为凝胶的“吸水量”，以 毫升每克表示）。因此，对一层析柱胶床来说，只要通过实际实验得 知某一物质的洗脱体积就可算出它的Kd值。如果假定蛋白质分子近于球形，同时没有显著的水合作用，则不 同大小分子量的蛋白质，在洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有 直接的定量的关系。在一根凝胶柱中，凝胶颗粒间空隙所含水相体积 为外水体积Vo,不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为Vo 时，出现洗脱峰。凝胶颗粒内部孔穴的总体积为内水体积Vi，能全部渗入凝胶的那 些小分子，当
5、洗脱体积为Vo+Vi时，出现洗脱峰。Ve与分子量的关 系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶 柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。Ve与分子量 的关系可用下式表示：Ve=K1-K2logM，式中M为相对分子质量，K1 和K2为常数,Ve也可用Ve-Voo二、仪器和试剂1. 标准蛋白质:蓝色葡聚糖-2000 (200KD)、牛血清蛋白(67KD)、胃蛋 白酶(36KD)、CytC(13.7KD)等，均为分析纯。2. 仪器:层析柱核酸蛋白检测器(或紫外分光光度计)、自动部分收集 器、刻度管。3. 试剂：蓝色葡聚糖 2000、SephardexG-75、洗脱液： 0
6、.2mol/LTris-HCL-KCL,PH7.5。三、实验步骤测定蛋白质的分子量根据需要可选用SephadexG-75、G-100或 G-150型凝胶，凝胶颗粒一般在40120微米，柱管选用直径1.0-1.3cm，高 90-100cm。1.标准曲线的制定：层析柱用1.2 100cm，凝胶用SephadexG-75或 G-100o(1)蛋白质标准样品混合液：分别称取4mg蓝色葡聚糖-2000(200KD)、牛血清蛋白(67KD)、胃蛋白酶(36KD)、CytC(13.7KD)共同 溶于 2ml PH7.5 0.025mol/L Tris-Hcl 缓冲液中。（2 ）上柱和洗脱：将标准样品混合液上
7、柱，然后用PH7.50.025mol/L Tris-Hcl缓冲液洗脱，流速15d/min，2ml/管，用部分收集 器收集，紫外检测仪280nm出检测，或收集后用紫外分光光度仪于 280nm出测定每管OD值，以管号（或洗脱体积）为横坐标，0D值 为纵坐标绘出洗脱曲线。根据洗脱峰位置量出每种蛋白质的洗脱体积（Ve）。然后以蛋白 质分子量的对数（lgM）为横坐标，Ve为纵坐标，作出标准曲线。为 了结果可靠，应以同样条件重复1-2次，取Ve平均值作图。2.未知数品分子量的测定：完全按照标准曲线的条件操作，根据紫外线检测的洗脱峰位置，得出体积。重复1-2次，取其平均值，由 标准曲线可查得样品的分子量。四
8、、实验结果牛血清蛋白蓝色葡聚糖-2000Ve (ml)OD值Ve (ml)OD值00.04100.03920.04120.00640.1640.0056060.00180.0180100.025100.015120.223120.341140.115140.15160.039160.07180.12180.048200200.04胃蛋白酶CytcVe (ml)OD值Ve (ml)OD值00.0270020.02920.00740.02440.02160.02660.01980.02680.018100.031100.076120.039120.185140.131140.252160.3041
9、60.215180.315180.118200.676200.077220.105220.057240.042240.047260.02260.034280.07280.025300.05300.013320320.01340.008作出洗脱曲线:牛血清白蛋白图表标题蓝色葡聚糖-2000胃蛋白酶图表标题Cytc绘出标准曲线如下:五、讨论1. 从洗脱曲线上可以看出，出现了四个较明显的峰值（实验结果较为 理想）：OD:0.233（Ve=12ml），0.341 （Ve=12ml），0.676 （Ve=20ml），0.252（Ve=14ml），分别对照试验中所加样的四种蛋白质。由于分子量大的 先洗脱出来，小分子量的蛋白后洗脱出来，因此洗脱顺序是蓝色葡聚糖-2000（200KD），牛血清白蛋白（67KD），胃蛋白酶（36KD），Cytc（13.7KD）。可能由于洗脱体积间差距较小，且每管体积为整数，导 致牛血清蛋白和胃蛋白酶之间洗脱体积差距未能体现出来2. 有标准曲线可以看出胃蛋白酶峰值出现的体积与其它三种样品差 距较大，不太符合正常规律，猜测可能是由于实验过程中的操作不规 范造成的。另外实验过程中，可能由于加样时凝胶柱上层部分遭到轻 微破坏，导致部分数据不太准确。
