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1、酵母蔗糖酶米氏常数的测定原理当环境的温度、pH和酶浓度等条件恒定时，酶促反应的初速度V随底物的浓度S增高 而加快，直至达到一极限，即最大反应速度 Vmax 根据底物浓度和反应速度的这种关系， Michaelis-Me nten 推导得出如下公式：VmaxS Km +S式中Km为米氏常数。它是酶的特征性常数。测定Km是研究酶的一项重要工作。大多数酶Km在10-3 10-5mol/L左右。但是Michaelis-Menten方程中反应速度V与底物浓度S之间为双曲线关系，通过作图求 Km 值极不方便。 Lin eweaver-Burk 根据米氏方程又推导出 如下直线方程：1Km11= + VVmax
2、SVmax以1/ S为横坐标，1/V为纵坐标，将各点连成一直线，此线向左延长与横轴相交处即 为米氏常数（Km）的负值。本实验是用比色法测定一定时间内、一定量的蔗糖酶作用于不同浓度的底物（蔗糖）生 成产物的量，即葡萄糖的量。此产物的生成量为反应速度，然后按 Lineweaver-Burk 双倒数作图法作图（图14），就可以求出Km值。SKm图 14 Lin eweaver-Burk 双倒数作图法试剂1. 0.03mol/L 蔗糖溶液。2. 0.2mol/L pH5.0 醋酸缓冲液：取 0.2mol/L 醋酸钠溶液 70ml 与 0.2mol/L 乙酸溶液30ml 相混合。3.蔗糖酶溶液：干酵母
3、2.5g 置研钵中，加蒸馏水 4ml ，用力研磨 10 分钟，转移到离心管 中，用 25ml 蒸馏水洗研钵，并 将洗涤液一起转移到离心管中，摇匀，静置50 分钟，离心(2000r/min 5min ),小心取出上清夜备用。置冰箱保存。实验时根据需要用蒸馏水适当稀 释。(约25 倍稀释)4. 碱性硫酸铜溶液：取无水 NatCO40g 溶于 400ml 蒸馏水中；酒石酸7.5g溶于350ml蒸馏水中；结晶硫酸铜(CuSO 5fO) 4.5g溶于200ml蒸馏水中，以上分别加热促溶。冷 却后将酒石酸溶液倾入NaCO溶液中，混匀。再将硫酸铜溶液倾入，并加蒸馏水至总量为Z1000ml。此试剂可在室温中长
4、期保存。如放置数周后生成沉淀，可用优质滤纸过滤后使用。5. 磷钼酸试剂：烧杯内加入钼酸70g,钨酸钠10g,10%NaO溶液400ml及蒸馏水400ml。煮 沸20 40分钟以除去钼酸内可能存在的氨。冷却移入1000ml容量瓶内，加浓磷酸(85%) 250ml，混 匀。最后以蒸馏水稀释至 1000ml。6. 葡萄糖标准溶液(0.05mg/ml):(1) 葡萄糖标准贮存溶液：(10 mg/ml):以分析天平称取1.000g纯葡萄糖，置于小烧杯中加0.25%苯甲酸溶液使溶解，倾入100ml容量瓶中以0.25%苯甲酸溶液稀释至刻度。(2) 葡萄糖标准应用液(0.05mg/ml):用吸管吸取上述葡萄糖
5、标准贮存液5.0ml放入1000ml容量瓶内，用0.25%苯甲酸溶液稀释致刻度。主要器材1. 恒温水浴及沸水浴2. 721 分光光度计主要操作步骤1. 将蔗糖酶溶液置 30 C 水浴预温 5 分钟。2. 取试管 5支，编号，按表 14操作。表 14试剂(ml)0.03mol/L蔗糖溶液蒸馏水0pH5.0醋酸缓冲液5.02.51.51.02.53.50.50.54.05.00.50.50.5充分混匀，30 C水浴预温5分钟蔗糖酶溶液0.50.510.50.50.5立即混匀，30 C水浴准确保温10分钟碱性硫酸铜溶液1.0 1.01.0 1.0 1.0混匀，中止酶反应。另取试管 6 支,编号。向
6、15 管加入上面相对应的 5 管反应液各 0.5ml ,再各加蒸馏水 1.5ml;第6管加入葡萄糖标准液2ml。然后按表15操作：表15试剂（ml）管号123456碱性硫酸铜溶液2.0 2.0 2.02.0 2.0 2.0混匀，置沸水浴8分钟，取出冷却磷钼酸试剂2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0混匀，静置3分钟蒸馏水2.0 2.0 2.0 2.02.0 2.0将各管混匀，选用 420nm 波长比色，以第 5 管作为空白管调零，第 6 管作为标准管，记 录各管 光密度。结果与计算14 号管酶促反应所产生的还原糖的mol 数按下式计算：还原糖（mol）=测定管光密度x 01亠x 1000标准管光密度0.5180按照Lineweaver-Burk作图法，以1/S为横坐标，10分钟内酶促反应产生的还原糖mol 的倒数 1/v 为纵坐标作图。将各点连成直线并延长此线与横轴相交点即为酵母蔗糖酶 的 Km 值的负值。
