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1、COOHHO-C-H+H-C-OH2OODHO-C-Hl+H2O2H-C-OHH-C-OHH-C-OHch2oh0-D-葡萄糖D-葡萄糖酸h3cnh2h5c-n.no4-氨基安替毗咻【器材】1分光光度计2.恒温水浴葡萄糖氧化酶法测定血糖含量【目的】1 .掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖含量的实验方法。2 .熟悉葡萄糖氧化酶法测定血糖含量的实验原理。【原理】葡萄糖氧化酶（GA）对B-D-葡萄糖的特异性的很强。溶液中的葡萄糖有a-D-葡萄糖和B-D-葡萄糖两型，二者处于动态平衡。当B-D-葡萄糖不断受酶催化而减少时，a-D-葡萄糖便依靠平衡移动，全部转变为B-D-葡萄糖参与反应。GA催化B-D-葡萄糖分
2、子中的醛基氧化生成葡萄糖酸和H2O2,后者在过氧化物酶（PA）作用下放出氧，其可将色原性氧受体“4-氨基安替吡啉偶联酚”的酚氧化，并与4-氨基安替吡啉缩合生成红色化合物，其反应如下。于505nm与同样处理的标准葡萄溶液比色，可测得葡萄糖含量。H-C=OH-C-OHH-C-OH3 微量加样器4 刻度吸量管5 中号试管【试剂】1 0.01mol/LpH7.0磷酸盐缓冲液无水Na2HPO418.5g和KH2PO45.3g溶于800ml蒸馏水中，用少量1mol/L的NaOH或HCl调pH至7.0，再加蒸馏水稀释至1L。2 酶试剂取GA1200单位、PA1200单位，4-氨基安替吡啉10mg、叠氮钠10
3、0mg，加上述磷酸盐缓冲液至80ml左右，调pH至7.0，再加同上缓冲液至100ml，混匀。冰箱内保存可稳定3个月。3 酚试剂酚100mg溶于100ml蒸馏水中。因酚易在空气中氧化成红色，可先配制成50g/dl，贮棕色瓶中，用前稀释。4 酶-酚混合试剂将试剂2、3等量混合。冰箱内保存可稳定1个月。5 葡萄糖标准贮存液(20mg/ml)无水D-葡萄糖于80C烤箱内干燥恒重，冷却后，称取2.0g以0.25%苯甲酸溶解、稀释定容至100ml。6 葡萄糖应用标准液(100mg/dl)取葡萄糖标准液5ml，加0.25%苯甲酸溶液稀释定容至100ml。7 蛋白沉淀剂溶解Na2HPO410g、Na2WO41
4、0g、NaCl19g于800ml蒸馏水中，加入1mol/LHCl125ml，加蒸馏水至1000ml混匀。【操作】1 血浆直接测定取试管3只，标明测定、标准、空白，分别加入血清20ul，磷酸盐缓冲液20口l，然后各管均加酶-酚混合剂各3ml，混匀后将3管同时置37C水浴保温15min，到时取出冷却。用505nm波长，以空白管调整零，读取各管吸光度值。2 .全血去蛋白血滤液测定取蛋白沉淀剂1ml加全血50口l混匀，放置7分钟后，离心取上清0.5ml于测定管内；取蛋白沉淀剂1ml加葡萄糖应用标准液50口l，混匀后从中取0.5ml于标准管内；另取蛋白沉淀剂0.5ml于空白管内。以上三管各加酶-酚混合试
5、剂3ml，各管分别混匀同时放入37C水恒温箱浴保温15min后，取出如前比色测定。【计算】测定管吸光度力他血糖浓度(mg/dl)=标血糖浓度(mmol/L)mg/di10面【注意事项】1.葡萄糖氧化酶法测糖，色原性氧受体种类较多，以往曾多用邻联茴香胺等,因其有轻微致癌作用，现已很少应用。本实验介绍的方法为卫生部临床检验中心所推荐，该法测糖显色灵敏且稳定。2.无水葡萄糖结晶属于a-D型，溶于水中，部分葡萄糖发生变旋光作用，形成B型，2小时后a与B比例达成平衡，a型占36%，B型占64%。因此葡萄糖标准液需在葡萄糖溶解2小时后才能应用。3 .该酶法测糖特异性高，且干扰测定结果的特质较少。当溶血标本Hb达到1g/dl，黄疸标本胆红素浓度达到20mgr/dl时，都不大影响测定结果。样品中加入抗凝剂或糖分解抑制剂如草酸钾浓度达到20mg/dl、脚素达60mg/dl、NaF达200mg/dl时，均不干扰测定结果。标本中尿素达280mg/dl、甘油三酯达500mg/dl时对测定结果无影响。而维生素C及谷胱甘肽等还原性物质可引起结果的负误差。4 .本法测糖的线性范围宽，至少可达20mmol/L(360mg/dl)。5 .本法测定血糖正常值为70110mg/dl或3.96.1mmol/L。【思考题】1酶试剂为什么要用磷酸盐缓冲液配制，而不用蒸馏水配制？2试分析影响本实验的因素有哪些，为什么？
