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1、色谱分离方法1根据分离原理还可将色谱法分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱、电泳色谱、气相色谱等。利用物质吸附能力不同进行分离的称为吸附色谱，常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭、大孔吸附树脂等。利用物质在两相不互溶的溶剂中的分配比不同进行分离的称为分配色谱，常用的支持剂有硅胶、硅藻土、纤维粉等，液滴逆流色谱（DCCC, droplet counter current chromatography）和高速逆流色谱(HSCCC , high speed counter current chromatography)则是在分配色谱与逆流分溶相结合的基础上发展而成的一种新技
2、术。利用物质解离程度不同进行分离的称为离子交换色谱，常用的离子交换树脂有强酸型（磺酸型）、强碱型（季胺型）、弱酸型（羧酸型）、弱碱型（三级胺型）等。利用物质分子大小不同进行分离的称为凝胶色谱（亦称分子筛或排阻色谱），常用的支持剂有葡聚糖凝胶、羟丙基葡聚糖凝胶等。利用电流通过时，离子趋电性不同进行分离的称为电泳色谱，常用的有纸电泳、琼脂电泳、凝胶电泳等。本书将根据其在天然药物分离工作中的重要性择要介绍。色谱法的特点是分离效果好，对于经典方法难以得到分离的化合物采用色谱法往往可以得到满意的分离，但对于所用的吸附剂或支持剂、试剂、仪器设备等要求较高，技术操作较细致，操作周期也较长，故在工业生产中用得
3、较少，目前主要是作为一种实验室常规分离方法用于天然药物中生物活性成分及化学成分的研究。由于天然药物中有效成分的结构类型不同，理化性质也不同，所以选择的色谱方法也是不同的，要根据具体情况选定。通常生物碱的分离可选用硅胶或氧化铝色谱，对于极性较强的生物碱可选用分配色谱或反相色谱，对于碱性较强的生物碱可选用离子交换色谱，对于水溶性生物碱如季胺型生物碱、氮氧化物生物碱等也可选用分配色谱或离子交换色谱。苷类化合物的色谱分离与苷元的性质有关，对于水溶性较大的苷如皂苷、强心苷等通常采用分配色谱或反相色谱分离，对于水溶性较小的苷则可采用吸附色谱分离。挥发油、甾体、萜类、萜类内酯（成苷者除外）等往往首选硅胶及氧
4、化铝色谱，若在氧化铝色谱上有次级反应，则宜用硅胶吸附色谱分离。黄酮类、醌类等含有酚羟基的化合物则可采用聚酰胺色谱进行分离。有机酸、氨基酸等含有羧基或氨基类的化合物通常可选用离子交换色谱进行分离，有时也可用分配色谱进行分离。氨基酸类化合物还可采用活性炭色谱进行分离。对于大分子化合物如多肽、多聚糖、蛋白质以及极性较大的化合物则通常采用凝胶色谱进行分离。第一节 硅胶柱色谱硅胶色谱是最常用的色谱方法，适用于亲脂性成分的分离，广泛用于萜类、甾体、强心苷、苯丙素、黄酮、醌类、生物碱等类化合物的分离。它具有价廉、分离效果好、再生容易、适用范围广、不易与有机酸、酚类以及色素等类化合物形成不可逆吸附，样品损失较
5、少、回收率较高、副反应较少等优点。但与氧化铝色谱相比，具有分离效果较差、样品处理量较少、对杂质的吸附能力较差等缺点。二 硅胶吸附色谱（一）色谱柱的选择有多种多样的色谱柱可供选择（见图2-1）。下端带有玻璃塞的或不带有玻璃塞的以及带有垂熔筛板的均可选用 。吸附色谱所用的洗脱剂均为有机溶剂，因有机溶剂可溶解在玻璃塞上起润滑和密封作用的凡士林，故对玻璃塞的密封和润滑需要用淀粉甘油糊，而不能用凡士林。在用不带有玻璃塞的色谱柱时，含氯的溶剂如氯仿、二氯甲烷等对胶管的腐蚀很大，常会导致胶管的膨胀和变形，在使用时要经常检查下端连接的胶管，以防洗脱剂发生泄漏，造成柱中的洗脱剂流干，导致分离的失败。柱内径与柱长
6、之比通常为1:101:20,若柱粗而短，则分离效果较差。若柱过长而细，分离效果虽好，但流速慢，消耗时间太长。样品长时间吸附在硅胶上和长时间被光照射会使样品中的某些成分发生变化，过长的柱子装填均匀难度也较大，故通常对于分离复杂样品常先使用短而粗的柱子进行粗分，然后对于已经过粗分且成分相对较简单的样品再用细而长的柱子进行分离。所用的色谱柱应比装入吸附剂的柱长再长一段，以备存有一定量的洗脱剂。为了防止溶剂的挥发及减少溶剂的加入次数，色谱柱上可覆一玻璃瓶或装一个分液漏斗，内存色谱用溶剂。（二）吸附剂的用量吸附剂的用量要根据被分离样品的组成及其是否容易被分开而决定。一般来说，吸附剂用量为样品量的2050
7、倍。若样品中所含成分的性质很相似，则吸附剂的用量要加大，可增至100倍或更大些。硅胶对极性较小的化合物如萜烯、倍半萜烯等的吸附力较弱，其用量应加大，可为样品量的100200倍。（三）装柱方法色谱柱要求填装均匀，且不带有气泡。若松紧不一致，则被分离物质的移动速度不规则，影响分离效果。装柱时首先将色谱柱垂直的固定在支架上，在管的下端塞少许棉花，使棉花成为一个表面平整的薄层，然后用下述方法装柱。1干装法 将硅胶均匀的倒入柱内，中间不应间断。通常在柱的上端放一个玻璃漏斗，使硅胶经漏斗成一细流状慢慢地加入柱内。必要时轻轻的敲打色谱柱，使填装均匀，尤其是在填装较粗的色谱柱时，更应小心。色谱柱装好后打开下端
8、活塞，然后沿管壁轻轻倒入洗脱剂（注意在洗脱剂倒入时，严防硅胶被冲起），待硅胶湿润后，在柱内不能带有气泡。如有气泡需通过搅拌等方法设法除去，也可以在柱的上端再加入洗脱剂，然后通入压缩空气使空气泡随洗脱剂从下端流出。2湿装法 因湿法装柱容易赶走硅胶内的气泡，故一般以湿法装柱较好。量取一定量体积的准备用作首次洗脱的洗脱剂（Vo），倒入色谱柱中，并将活塞打开，使洗脱剂滴入接受瓶内，同时将硅胶慢慢的加入；或将硅胶放置于烧杯中，加入一定量的洗脱剂，经充分搅拌，待硅胶内的气泡被除去后再加入柱内（因后一种方法对硅胶内的气泡除去的较完全，故最常用）。一边沉降一边添加，直到加完为止。硅胶的加入速度不宜太快，以免带
9、入气泡。必要时可在色谱柱的管外轻轻给与敲打，使硅胶均匀的下降，有助于硅胶带入的气泡外溢。硅胶加完后，仍使洗脱剂流滴一段时间，然后使色谱柱中高于硅胶面上的洗脱剂几乎全部流入接受瓶内，正确计量接受器中的溶剂量（V1），Vo-V1之差即为色谱柱内包含的洗脱剂的体积，即色谱柱的保留体积。知道保留体积多少，就能主动掌握大致在什么时侯收集洗脱液，当变换洗脱剂的时侯，也能估计到新洗脱剂的流份在什么时侯开始。为了使色谱柱装的更加均匀，提高分离效果，同时也为了除去硅胶中含有的杂质，通常是色谱柱装好后，先不急于上样品，而是先用洗脱剂洗脱一天，待回收洗脱剂后回收瓶中没有残渣时在上样品。（四）样品的加入 样品的加入有
10、两种方法，即湿法加样和干法加样。湿法加样虽然具有吸附剂对样品的死吸附较少和样品回收率较高等优点，但因所用溶剂较难选择、样品谱带较宽以及获得均匀的样品谱带较难等缺点，故较少使用。1湿法加样 先将样品溶解于用作首次使用的洗脱剂的溶剂中，如果样品在首次使用的洗脱剂中不溶解，可改用极性较小的其它溶剂，但溶剂的极性要尽可能的小，否则会大大的降低分离效果，并有可能导致分离的失败（需完全溶解，不得有颗粒或固体）。溶液的体积不能过大，体积太大往往会使色带分散不集中，影响分离效果，通常样品溶液的体积不要超过色谱柱保留体积的15。先将色谱柱中硅胶面上的多余洗脱剂放出，再用滴管将样品溶液慢慢加入，在加入样品时勿使柱
11、面受到扰动，以免影响分离效果。2干法加样 先将样品溶解在易溶的有机溶剂中。样品体积不要太大，通常不要超过色谱柱保留体积的30，否则会造成死吸附过多和大量样品进入多孔性硅胶的内部，影响分离效果和降低样品的回收率，同时样品与硅胶一同加热时间过长，也会导致样品中的某些成分发生变化。但样品体积也不宜太小，样品体积太小会造成溶液过浓，同样也会影响分离效果。称取一定量硅胶（通常为色谱柱中硅胶量的1015），置于蒸发皿中，用滴管慢慢加入样品溶液，边加边搅拌，待硅胶已完全被样品溶液湿润时，在水浴锅上蒸除溶剂，如果样品溶液还没有加完，则可重复上述步骤，直到加完为止。蒸除溶剂后的附有样品的硅胶在100 C加热3小
12、时除去水分后，按湿法装柱的方法装入柱内，但要注意在样品加入时不要使柱面受到扰动。(五)展开与洗脱 样品溶液全部加完后，打开活塞将液体徐徐放出，当液面与柱面相平时，再用少量溶剂洗涤盛样品的容器数次，洗液全部加入色谱柱内，开始收集流出的洗脱液，当液面与柱面相同时，缓缓加入洗脱溶剂，使洗脱剂的液面高出柱面约10厘米。在柱面上加入一个直径与色谱柱内径相同的并扎有许多小孔的滤纸片，然后再加入约两厘米厚的硅胶（慢慢加入，并缓缓搅拌，尽量除去硅胶中的气泡），最后在硅胶上方加入一团脱脂棉花，以防止每次加入洗脱溶剂时破坏色谱柱面，影响分离效果。有色物质在日光下即可观察到明显的色谱带，有些无色物质虽然在日光下观察
13、不到色谱带，但在紫外光的照射下可以观察到明显的荧光色谱带。流份的收集既可按色谱带收集，也可按等馏份收集法收集。由于一个色带中往往含有多个成分，故现在常常采用等馏分收集法收集，即分取一定洗脱液为一份，连续收集。理论上每份收集的体积越小，则将已分离开的成分又重新人为地合并到一起的机会就越少，但每份收集的体积太小，必然要大大的加大工作量。每份洗脱液的收集体积，应根据所用硅胶的量和样品的分离难易程度的具体情况而定，通常每份洗脱液的量约与柱的保留体积或硅胶的用量大体相当。如所用硅胶的量为200g，则每份洗脱液收集的量约为200ml。但若所用洗脱剂的极性较大或被分离成分的结构很相近，则每份的收集量要小一些
14、。为了及时了解洗脱液中各洗脱部分的情况，以便调节收集体积的多少和选择或改变洗脱剂的极性，现在多采用薄层色谱或纸层色谱的方法来检查。根据色谱的结果，可将成分相同的洗脱液合并或更换洗脱剂。采用薄层色谱或纸层色谱的方法来检查洗脱液的分离情况，既可在回收溶剂之前，也可在回收溶剂之后，应根据具体情况而定。通常当上样量较大时，回收溶剂后进行，当上样量较少时，则在回收溶剂之前进行。回收溶剂后，用易溶的溶剂溶解，在放置过程中有时可得到单一成分。如果仍是几种成分的混合物，则还需进行进一步的分离。在整个操作过程中，必须注意不使吸附剂表面的液体流干，否则会使色谱柱中进入气泡或形成裂缝。同时洗脱液流出的速度也不应太快
15、，流速过快，柱中交换达不到平衡，均能影响分离效果。(六)洗脱剂（展开剂）的选择硅胶、氧化铝等对天然药物中生物活性成分及化学成分的吸附属于物理吸附（physical adsorption）,亦称表面吸附，是由于吸附剂表面分子与溶质及溶剂分子的分子间力相互作用而引起的。物理吸附的特点是无选择性、吸附与解吸附过程可逆、且可快速进行，吸附强弱及先后顺序大体遵循“相似者易于吸附”的经验规律。在分离过程中溶质分子与溶剂分子、溶质分子相互间对吸附剂表面发生不断争夺。由于化学结构不同，其性质就不同，对吸附剂表面的争夺能力也就不会相同，故可以通过色谱方法将不同化学结构的成分分开。同样溶剂不同，其对吸附剂表面的争
16、夺能力就不同，故溶剂不同，其洗脱能力也就不同。硅胶、氧化铝等均为极性吸附剂，故有以下特点：化合物的极性越强，吸附剂对其吸附力就越强，流出柱的速度就愈慢或Rf值就越小；洗脱剂的极性越大，其洗脱能力就愈强；吸附剂的含水量愈大，其对化合物的吸附力就愈弱。值得注意的是洗脱剂的洗脱能力与其极性虽有关系，但并不呈线性关系，如极性大体相同的氯仿丙酮混合液和氯仿甲醇混合液，其对化合物的洗脱能力可能会相差很大，有时用前者可以将几个化合物分开，用后者就不一定能分开，但也有可能相反。在分离过程中不仅要考虑化合物与吸附剂表面的相互作用，而且还要考虑化合物与洗脱剂间的相互作用，如形成分子间氢键、洗脱剂对化合物的溶解度等。再选用洗脱剂时，应从低极性溶剂开始，然后逐步增加洗脱剂的极性，使吸附在吸附剂上的成分逐个被洗脱下来，从而达到分离的目的。如果样品极性小，可选用石油醚或（环）己烷作为起始溶剂，如果样品极性较大则可选用氯
