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1、甘草有效成分的提取分离实验方案实验目的：通过对甘草中甘草黄酮、甘草酸和甘草多糖的提取分离，进一步 理解他们的理化性质，并且初步掌握提取分离的方法。实验原理：黄酮类化合物则泛指两个苯环（A环与B环）通过中央三碳相互 联接而成的一系列化合物。根据中央三碳的氧化程度、是否成环、B 环的联接位点等特点，可将该类化合物分为多种结构类型。代表化合 物有甘草黄酮、甘草素、异甘草素、甘草甙、异甘草甙、甘草查尔酮 等。甘草中已经发现的黄酮类化合物有一百多种，本实验只对其进行 粗提，并且测定其总含量。甘草酸是一类三萜类皂苷，主要以甘草酸钾、钙盐的形式存在， 是甘草次酸的二葡萄糖醛酸甙，含量在4-20%之间；甘草酸
2、水解脱去 糖酸链变形成了甘草次酸。超临界C02萃取甘草总黄酮的萃取率是1. 35%，含量32. 45%, 是索氏提取法提取甘草总黄酮的提取率的2.2 倍，索氏提取溶剂用量 是超临界CO2萃取的6倍。本实验采取超临界CO2萃取法提取甘草黄 酮。【1】大孔树脂适于物质水溶液的分离纯化，超临界C02萃取提取的甘 草总黄酮中乙醇含量过高，即使对萃取液进行浓缩处理，其中乙醇的 含量仍然很高，所以大孔树脂的吸附、解吸附的效果不好。萃取液浓 缩近干加入水后，所要分离的物质析出变混浊，也不适合用大孔树脂 进行分离纯化。与大孔树脂层析比较，硅胶柱层析可以更有效的分离 纯化甘草黄酮。使用硅胶柱层析可以有效地使甘草
3、黄酮类物质的含量 达到 55%以上，收率1. 12%，符合国家中药二类新药的原料要求。【1】 综合考虑，本实验选择硅胶柱层析对甘草黄酮进行分离纯化。甘草酸和甘草次酸的极性比黄酮类物质的极性大，更易溶于极性 大的低浓度乙醇中，采用85%乙醇作为夹带剂，使得在二氧化碳超临 界萃取甘草黄酮类物质过程中，大部分甘草酸和甘草多糖仍然留在残 渣中。鉴于甘草酸和甘草多糖都溶于水的性质，本实验采用超声或微 波辅助法对它们同时进行提取3。对于提取后的甘草酸和甘草多糖的分离，可查阅到的方法包括醇 沉酸沉法3。考虑到大孔吸附树脂对糖类的吸附能力很差，也可以尝 试用大孔树脂对甘草酸和甘草多糖进行分离。本实验采用前者进
4、行分 离。一、甘草黄酮的提取：超临界C02萃取法工艺【1】：原料粒度:40-60目投料量：180g/罐萃取压力:30Mpa萃取温度：50 0C夹带剂及液固比：85%乙醇，液固比（V： W）为5:1C02 流量：l0kg/h萃取时间:5 小时分离压力:5. 5Mpa.分离温度：40oC二、甘草黄酮的分离纯化：硅胶柱层析工艺【1】：萃取液浓缩干品:硅胶量=0.5:20流速：1.0倍柱体积/小时流动相： CHCl : CH30H=4 :13三、甘草酸和甘草多糖的提取：超声辅助溶剂提取法 工艺【1】：溶剂：水提取次数： 3 次，每次 25min温度： 450C固液比=1: l0超声功率： 1000W四
5、、甘草酸和甘草多糖的分离：醇沉酸沉法5(1) 萃余相用95%乙醇或无水乙醇调节至乙醇浓度为5080%,静置 824小时，过滤，上清液备用，滤渣干燥得甘草多糖粗品。(2) 上清液浓缩至20C时的比重为1.051.20，用硫酸或盐酸调pH 至1.52.0,室温或410C低温静置848小时，去上清液，沉淀 物用冷水或冷酸水洗涤至洗涤水pH35,沉淀物干燥得甘草酸粗品。五、含量测定：分光光度法1、甘草黄酮含量测定1标准曲线绘制：精密称取在105C干燥恒重的芦丁对照品适量，用95% 乙醇溶解，摇匀，定容使之成为浓度为 1mg/ml 的芦丁标准品溶液， 作为贮备液。精密量取上述溶液0, 0.1, 0.2,
6、 0.3, 0.4. 0.5, 0.6m1， 分别加水至3ml,加5%亚硝酸钠水溶液0. 5m1，放置6分钟，加10% 硝酸铝0.5ml,混匀后放置5分钟，加入5%氢氧化钠溶液25ml,混匀， 放置15分钟后，蒸馏水定容至lOml。用721紫外分光光度计，在入 =500nm 处测吸收度。以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标做标 准曲线。含量测定：测出样品吸光度，带入回归方程，计算得出样品浓度。2、甘草多糖含量测定3标准曲线的制备：精密称取干燥恒重的葡萄糖 0.0194g, 配成 1OOml 溶液，浓度为 0.194mg/ml。从中精密吸取 O.lml, 0. 2m1,0.3m1, 0.5ml,
7、 0.7ml, 0.9m1，分别加入1 ml苯酚溶液和5ml浓硫酸,30C恒温0.5h， 冷水浴冷却至室温，定容到50ml，在490nm处测定吸光度。以不加 样为空白。以浓度 C 对吸光度 A 回归, 做回归方程。含量测定：测出样品吸光度，带入回归方程，计算得出样品浓度。3、甘草酸含量测定3 标准曲线的制备：精密称取适量甘草酸标准品，配成 0.4217mg.m1-1 的标准溶液。分别精密量取 1.00m1, 2.00m1, 3.00m1,4.00m1 的标准 溶液，用50%的乙醇溶液稀释至250m1,在最大吸收波长入max= 259nm 处测吸收度，以空白为参比液，得线性回归方程. 含量测定：测出样品吸光度，带入回归方程，计算得出样品浓度。1 付玉杰.甘草黄酮和甘草酸提取纯化工艺研究D东北林业大学,2002.2 王巧娥.甘草有效成分的新型提取技术及高速逆流色谱分离方法研究D.厦门大学，2004.3 李炳奇，刘振华,马燕.超声法联合提取甘草渣中多糖和甘草酸的研究J.现代食品科技,2006,04:26-28.4 李春英.甘草多糖提取纯化工艺研究D东北林业大学,20025 专利号：
