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1、脂肪源干细胞修复兔膝关节全层软骨缺损研究【摘要】观察评价兔膝关节髌股关节面中心人工制造全层关节软骨缺损后，单纯脂肪源干细胞复合海藻酸钙凝胶移植到软骨缺损处对关节全层软骨缺损的修复效果，以探究关节软骨缺损修复简单有效的途径。方法新西兰大白兔27只随机分为A、B、三组，A组关节软骨缺损处置入海藻酸钙凝胶，B组软骨缺损处不做任何处理，组缺损处置入未经诱导的脂肪源干细胞复合海藻酸钙凝胶，分别于术后第4、8、12周处死动物，通过大体、组织切片观察以及透射电镜等技术手段对修复效果进展观测，采用改进的akitani评分标准对修复组织进展评分，所得评分采用统计软件SPSS11.5进展统计学分析。结果A、B组软
2、骨缺损处为纤维组织状物填充，组织学切片可见为原纤维覆盖，组软骨缺损处为类透明软骨组织填充，组织切片可见类软骨细胞及其周围的陷窝，电镜下可见细胞周围大量胶原纤维，组在各个时期与A组、B组的评分比拟差异都具有统计学意义(P0.01)，示组修复效果较其他两组为优。结论单纯脂肪源干细胞复合海藻酸钙凝胶可有效修复关节软骨全层缺损。【关键词】脂肪源干细胞海藻酸钙软骨Abstrat:bjetiveTevaluatetheeffetfntinduedadipsederivedsteells(ADSs)ithaliualginatehealingfull-thiknessartilagedefetsfrabbi
3、tkneeafterthedelasadeinenterfferalfaiespatellarisartifiially,inrdertfindasipleandrkingayfartiularartilagedefetrestratin.ethdTenty-sevenNeZealandhiterabbitseredividedintA,B,grupsrandly.aliualginateastransplantedtartilagedefetpsitinfrabbitsfgrupA,nthingfrgrupBandaliualginateithntinduedADSsfrgrup.Thean
4、ialserekilledin4th,8thand12theeklater.Restredtissueasevaluatedusingnakedeyes,histlgialsetinandtransissineletrnirspy,sreasgivenardingtdifiedakitanigradestandard.ThettalsreasanalyzedithstatistisftareSPSS11.5.ResultArtiularartilagedefetsftheanialfgrupsAandBerefilledithfibrustissuehihntainsprtfiberhenit
5、ashekedusinghistlgialsetinandirspy.Thedefetasfiledithhndryte-liketissue.hndryte-likeellssurrundedithlauneserebservedinhistlgialsetin.Plentyfllagenfibersarundellsuldbeseenundertransissineletrnirspy.GruphadasignifiantstatistialdiffereneparedithgrupsAandB(P0.01)ineahperidhihshedthatgrupgtabetterindiati
6、nthanthertgrups.nlusinNn-induedADSsithaliualginateuldrepairefull-thiknessartilagedefetfrabbitkneeeffetively.Keyrds：ADSs;aliualginate;artilage关节软骨的自身修复才能有限，其损伤后的修复一直是骨科界的难题之一。随着干细胞培养技术和组织工程技术的不断进步，多种组织工程方法被应用来探究软骨缺损治疗的可行性。2001年ZukPA和Zhuin1等从人脂肪组织悬液中第一次别离获得了多向分化干细胞。目前已证实脂肪组织来源干细胞adipsederivedsteells,A
7、DSs能向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞及心肌细胞定向诱导分化2。本实验将单纯脂肪源干细胞复合藻酸钙凝胶载体填充修复兔膝关节全层软骨缺损，对实验结果进展观察分析，以讨论单纯脂肪源干细胞应用于关节软骨缺损修复的可行性，为关节软骨缺损修复探究简单有效的途径。1材料和方法1.1实验材料1.1.1主要仪器(1)超净工作台(JHT-DD型，济南康宝净化设备)；(2)恒温孵育箱(Heraeus公司，德国)；(3)倒置相差显微镜(NiknTE2000，日本)；(4)50l培养瓶(rning公司，美国)；5低温高速离心机Heraeus公司，德国。1.1.2主要试剂(1)DE培养基(Gib公司，美国)；
8、(2)型胶原酶(Siga公司，美国)；(3)胰蛋白酶(上海华美公司，中国)；(4)胎牛血清(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)；(5)D-Hanks平衡盐Siga公司，美国；6海藻酸钠上海化学试剂站分装厂；7氯化钙上海生工生物工程。2实验方法2.1脂肪源干细胞的获娶培养和鉴定将新西兰大白兔致死，无菌取双侧髂窝处脂肪组织约10l，用2倍体积D-Hanks平衡盐液漂洗3遍，剪成111大小，参加0.2%型胶原酶5l置于37温箱内消化0.5h，低温高速离心机内1000r/in离心10in弃上清，参加160l/LNH4l约5l裂解红细胞10in，筛网过滤，按8000个/2种植于50l培养瓶中。培养瓶置于
9、37体积分数为5%的2恒温孵育箱内。24h后首次换液，去除剩余红细胞及未贴壁细胞，后每隔23d换液一次，交融达80%以上时传代，动物实验用细胞传至第4代。取局部2代细胞采用含10%FBS，0.1l/L地塞米松，50l/L维生素，10l/L-甘油磷酸钠，100U/l青霉素，100U/l链霉素的DE诱导培养基向成骨细胞方向诱导。2.2动物实验选择安康成年新西兰大白兔27只购自山东鲁抗实验动物中心，体重2.53.5kg，雌雄不限。编号后随机分成A、B、3组，每组9只，双膝均用于实验。10%水合氯醛耳缘静脉麻醉，取双侧膝关节内侧切口，将髌骨推向外侧，进入关节腔。分别于左右两侧用直径3.5的钻头在髌股关
10、节面中心造成全厚关节软骨缺损，深度以点状出血为止，约2.5。A组：18膝缺损处单纯置入海藻酸钙凝胶。B组：18膝，空白对照，缺损处不作任何处理。组：18膝，置入培养的脂肪源干细胞海藻酸钙凝胶复合物，细胞最终浓度不低于2.0106l。术毕兔清醒后，放置笼内自由活动，青霉素肌注连续5d。2.3检测方法2.3.1细胞学检测生物学特性观察：观察细胞生长情况；取局部2代细胞制成细胞爬片做油红染色；另取局部向成骨细胞方向诱导的2代细胞制成细胞爬片做VnKssa染色观察矿化结节，以证实所培养细胞有无干细胞特性。2.3.2修复组织检测分别于术后4、8、12周处死动物，取材行大体、光镜组织学检查及电子显微镜下观
11、察。(1)大体观察：膝关节滑膜有无充血水肿，关节囊有无粘连及修复组织的平整度、光泽度；(2)组织学检测：将标本脱钙、梯度酒精脱水，常规石蜡包埋、切片，HE染色和甲苯胺兰染色，进展光镜下组织学观察；3透射电镜观察：取12周修复组织，包埋后超薄切片，观察细胞及基质情况。2.4统计学分析根据改进的akitani评分标准(见表1)采用盲法对各标本进展组织学评分。每一标本均有3人进展评分，取均数，所得评分结果应用SPSS11.5统计软件进展多因素方差分析，与对照组比拟采用Dunnett检验。表1软骨缺损修复的组织学评分标准指标组织学表现评分3结果3.1脂肪源干细胞培养及诱导细胞于接种后24h左右开场贴壁
12、，细胞形态呈长梭形、三角形或多角形图1。细胞生长旺盛，34d即可传代。取局部2代细胞制成细胞爬片做油红染色，苏木素复染细胞核，胞质未被油红着色图2，可见胞质中不含脂质，与脂肪谱系细胞无相关性。细胞培养7代后仍然增殖旺盛。向成骨细胞方向诱导的2代细胞制成细胞爬片做VnKssa染色，可观察到形成的矿化结节有Ag+沉积而呈黑色见图3，说明所培养的脂肪源干细胞有向成骨细胞分化的才能，有潜在的分化特性，具有干细胞特征。3.2大体观察术后34d动物轻度跛行，1周左右恢复正常。膝关节无红、肿、热等炎症现象。处死动物后见关节液清亮，关节囊无挛缩、粘连和新生物形成，滑膜无充血水肿，软骨无侵蚀，关节边缘无骨赘形成
13、。术后4周，A、B组缺损处修复组织根本一样，缺损处未完全填充，修复组织为灰白色，基底部呈深红色，未见明显的炎性肉芽组织；组缺损处亦未完全填充，但修复组织呈黄白色外观，外表粗糙；呈连绵的小丘状，与周围关节软骨分界清楚。术后8周，A、B组缺损处修复组织仍根本一样，缺损处未完全填充，但较前为多，修复组织仍为灰白色，外表粗糙，组缺损处未完全填充，修复组织亦较以前为多，淡黄白色，外表变的光滑，有一定弹性，与周围正常软骨分界仍能识别。术后第12周，A、B组缺损多完全填充，根本为纤维组织状物覆盖，外表与正常软骨齐平，深灰白色，质软，与周围正常软骨组织分界清楚，易剥离；组缺损区修复组织色泽、质地同正常关节软骨
14、，外表光滑，与周围软骨组织界面平齐并完全整合，结合严密，不易剥离，与周围正常软骨组织界限模糊图4。3.3组织学观察术后4周，A、B组见缺损区凹陷，有血凝块，被覆纤维组织，甲苯胺兰染色呈无异染性着色的纤维组织；组见少量增殖的类似幼稚软骨细胞的细胞和较少的基质，细胞排列稍紊乱、不规那么，细胞形态较小，周围无典型的陷窝样构造，甲苯胺兰染色异染性不明显，未见明显的多核炎性细胞。术后第8周，组织学与第4周相似，A、B组缺损区有纤维组织覆盖,有原纤维形成，呈波纹状走行，修复组织异染，少而不均匀；组修复组织中可见到较多的类幼稚软骨细胞和基质，类软骨陷窝多见，细胞分布不均，呈明显的甲苯胺兰异染性着色。术后12
15、周，A、B组修复组织多为较厚的原纤维，少数未曾完全填充，原纤维呈波纹状排列，未见软骨陷窝形成，甲苯胺兰染色少而不均匀；组修复的类软骨组织和周围的正常软骨根本连成一片，类软骨细胞的形态似正常软骨细胞，但排列非柱状，较正常软骨细胞不规那么，类软骨细胞周围可见类软骨陷窝见图5,未见炎性细胞浸润，甲苯胺兰着色较前均匀。3.4透射电镜观察透射电镜下可见藻酸钙凝胶孔径大，交联较严密、壁厚。A、B组4周可见到缺损处有较多的红细胞，8、12周缺损由纤维组织充填,多为层状排列的纤维组织，4周海藻酸钙局部降解，8周大局部降解；组8、12周，修复组织中可见类幼稚软骨细胞，细胞呈圆或椭圆形，外表有不规那么的突起，胞质中可见丰富扩张的粗面内质网和小而圆的线粒体，周围有较多的基质，周围基质内有纤细的纵横排列的胶原纤维(图6)。4周海藻酸钙局部降解，8周大局部降解。3.5统计软件分析结果脂肪源干细胞海藻酸钙凝胶复合物移植组得分与其他两组相比各时期有显著性差异(P0.01)。进一步采用Dunnett检验，单纯移植海藻酸钙凝胶组与空白对照组之间各个时期无显著性差异(P0.01)。见表2表2组织学评分时间4讨论关节软骨是一种高分化的组织，其自行修复后一般为纤维组织或纤维软骨组织，形成透明软骨组织的才能有限。软骨细胞移植可形成透明软骨修复3
