免疫组化实验步骤

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1、免疫组化实验步骤免疫组化操作步骤一、实验原理与意义 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗 体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、 定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起 来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平 检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等）。（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7. 27. 4）：NaC137mmol/L，KCl2. 7mmol/L ,Na

2、2HPO44.3mmol/L, KH2PO41.4mmol/L.20.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6. 0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。3O.5mol/L EDTA缓冲液(ph8. 0 ): 700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O用 10mmol/L NaOH 调至 ph 8.0, 加水至1000ml.4. 1mol/L 的 TBS 缓冲液(ph8. 0)：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH 8.0,加 水 1000ml。5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7. 8)配制。b.0

3、.4%胃蛋白酶液：用0.1 N的HCl配制。6. 3%甲醇_H2O2溶液：用 30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9. 0-9. 5 )等量混合b油和TBS(PBS)配制8TBS/PBS PH9.0-9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7. 4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60弋恒温箱中烘烤 20分钟。a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10 分钟,更换二甲苯后在浸泡 10 分 钟b无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复： 用于福尔马林固

4、定的石蜡包埋组织芯片：A抗原热修复a高压热修复在沸水中加入EDTA（ph8. 0）或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。 将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五 分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10 分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。 此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 b 沸热修复电炉或水浴 锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0 ）至95弋左右，放入组织芯片加热10-15分钟。c微波炉加热在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1- 2次。适

5、用的抗原：Bcl-2. Bax.AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit.c-myc.E-cadherin. ChromograninA.Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki- 67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等B酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37弋，消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collage n. GFAP Compleme nt.Cytokerati n. C-erB-2. LCA.LN.等3、免疫组化染色SP法(1

6、) 脱蜡、水化(2) PBS洗2-3次各5分钟(3) 3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA 上,室温静置10分钟(4) PBS洗2-3次各5分钟(6)PBS洗2-3次各5分钟( 7 )滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体(8 )滴加I抗50M室温静置1小时或4弋过夜或371小时(9 )4弋过夜后需在37弋复温45分钟(10 ) PBS洗3次每次2分钟(11 )滴加口抗45-50M室温静置或371小时(12 ) 口抗中可加入0.05% 的 twee n-20.(13 ) PBS洗3次各5分钟(14 ) DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度(15 ) PBS或自来水冲洗1

7、0分钟( 16 )苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化(17) 自来水冲洗10-15分钟(18) 脱水、透明、封片、镜检。4、SABC 法(1) 脱蜡、水化(2) PBS洗2次各5分钟(3 )用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分 钟，用蒸馏水洗3次(5) PBS洗5分钟( 6 )滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体(7 )滴加I抗50M室温静置1小时或4弋过夜或37弋1小时 (8)PBS洗3次各2分钟(9 )滴加生物素化口抗，20弋-37弋20分钟(10 ) PBS洗3次各2分钟(11 )滴加试剂 SABC 20C-30C 20 分钟(12 ) PBS洗4次各5分

8、钟(13 ) DAB 显色： 试剂盒或自配显色剂显色(14)脱水、透明、封片、镜检。免疫组化问题解答1、染色过强原因解决方法a抗体浓度过高或孵育时间过长降低抗体滴度、抗体孵育时间： 室温1小时或4度过夜b孵育温度过高超过37度一般在室温20-28度c DAB显色时间过长或浓度过高显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准2、非特异性背景染色 原因解决方法a操作过程中冲洗不充分每步冲洗3次每次5分钟b组织中含过氧化物酶未阻断可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时 间延长c组织中含内原性生物素正常非免疫动物血清再封闭d血清蛋白封闭不充分延长血清蛋白封闭时间3、染色弱原因解决方法a抗体浓度过低、孵育

9、时间过短提高抗体浓度、孵育时间不能少于 60分钟b试剂超过有效使用时间应更换试剂c操作中添加试剂时缓冲液未沥干每步滴加试剂前沥干切片中多余 的缓冲液使试剂稀释（应防止切片干燥）d 室温太低低于15度要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过夜e蛋白封闭过度封闭不要超过12分钟4、染色阴性原因解决方法a操作步骤错误应重试设阳性对照b组织中无抗原设阳性对照以验证试验结果c抗与二抗种属连接错误仔细确定一抗二抗种属无误 三步法（SP系列），实验步骤使用说明：SP9001 （兔）适用于兔来源的一抗SP9002 （小鼠）适用于小鼠来源的一抗SP9003 （山羊）适用于山羊来源的一抗SP9000

10、（通用型）适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗3.0ml-价格230.00 /6. 0ml-价格380.00 /18ml -价格1080.00 试剂盒规格及贮存条件规格：3ml（50 片）/6ml（120 片）/18ml（360 片）贮存条件：本试剂盒宜4弋保存，稳定期1年一、试剂盒内容试剂 1 封闭用非免疫的驴血清工作液（含 10%驴血清）即用型试 剂2生物素化二抗（驴抗兔/鼠/山羊）即用型试剂3链酶卵白素-碱磷酶轭合物即用型 试剂3过氧化物酶标记链酶卵白素即用型 实验步骤简介：1. 细胞爬片： 冷丙酮或4%的多聚甲醛固定的细胞爬片，置0.1mol PBS室温10分钟复水。2. 修复：滴加复合消化

11、液（0.125胰蛋白酶% +0. 1胃蛋白酶%+0.01 EDTA%）（0.1molPBS 配制）4 度 30-40 分钟0.1mol PBS洗三次，每次一分钟3. 血清封闭：（试剂1）室温10分钟，倾去。4. 抗：37弋1小时或4度过夜5.0.1mol PBS洗三次每次三分钟6相应的生物素化二抗（试剂2 ）3730-40分钟7.0.1mol PBS洗三次每次三分钟7. 链酶卵白素-碱磷酶轭合物或过氧化物酶标记链酶卵白素（试剂3）37C40分钟9，NBT/BCIP 或 DAB 显色，切片经梯度酒精脱水干燥，（二甲苯 透明），中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直 接用水性封片

12、剂。灏洋生物15:14:49名称：connexin 43CM7269 价格/规格： 0.1ml/20ug 技术指标：小鼠抗人，大鼠，小鼠单克隆抗体Ig分类：IgG2a适用组织：冰冻/石蜡阳性部位：细胞浆组织处理：O.1mol枸橼酸缓冲夜-热修复15分钟（95度）产品说明: 产地:Cellscience二步法（无生物素PV6000系列）， 实验步骤使用说明： 试剂盒组成 试剂A:3% H2O2试剂B:Polymerized HRP-Anti Mouse 或 Rabbit IgG3. 0ml/5. 0ml/18ml（根据一抗宿主而定）PV6001 （兔）适用于兔来源 的一抗PV6002 （小鼠）适

13、用于小鼠来源的一抗PV6000 （通用型）适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗3.0ml-价格300.00 /6. 0ml-价格580.00 /18ml-价格 1780.00试剂盒规格及贮存条件规格：3ml（50 片）/6ml（120 片）/18ml（360 片）贮存条件：本试剂盒宜4弋保存，稳定期1年免疫组化染色步骤1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（pH7. 4）冲洗三次，每次3分钟（3x3 ）。2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。3. 如果有必要，每张切片加1滴（试剂A ）室温下孵育10分钟， 以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS 冲洗 3x3。4. 除去PBS液，每张切片

14、加1滴或50pl的第一抗体（用户自选）, 室温下孵育60分钟或4弋过夜，建议参见每种抗体的说明书。5. PBS冲洗3x5。除去PBS液，每张切片加1滴或50pl酶二抗 聚合物（试剂B），室温下孵育40分钟或37度孵育30分钟或4度过夜。PBS冲 洗 3x3。6. 除去PBS液，每张切片加1滴或50pl新鲜配制的DAB或AEC 溶液（详见DAB或AEC使用说明书），显微镜下观察3-5分钟（DAB ） 或10分钟（AEC）。7. 自来水冲洗，苏木素复染，若有必要，可用0.1%HCI分化，自来水冲洗，PBS返蓝。8. 如果用 DAB 显色，则切片经梯度酒精脱水干燥， （二甲苯透明） ， 中性树胶封固；如果用 AEC 显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水 性封片剂。封片。灏洋生物15:15:15名称：connexin 43CM7269 价格/规格：0.1mI/20ug技术指标：小鼠抗人，大鼠，小鼠单克隆抗体ig分类：IgG2a适用组织：冰冻/石蜡阳性部位：细胞浆组织处理：0.1mol枸橼酸缓冲夜-热修复15分钟（95度）产品说明：产地:Cellscience二步法（无生物素PV6000系列），实验步骤使用说明： 试剂盒组成试剂A: