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1、微卫星 DNA简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，也可称为SSRP(Simple Sequence Repeat Polymorphisms), STMS (Sequence-tagged microsa tellit es)。其串联重复的核 心序列为1 一 6 bp，其中最常见是双核昔酸重复，即(CA) n和(TG) n每个微卫 星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10 一 60个，其高度多态性主要来源 于串联数目的不同。SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引 物,通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够 用PCR的方法扩增出不同长度的PCR
2、产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离 片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。SSR具有以下一些优点：(l) 一般检测到的是一个单一的多等位基因位点； (2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。显然， 在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信 息。如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。1 微卫星 DNA 的构成及特点微卫星又称简单序列重复(Simple Se-quence Repeats，SSR)。一般 以 1-6 个碱基为核心序列，首尾相连组成的串联重复序列。这种序列存在于几乎 所有真核生物的基因组中，含量丰富
3、，且呈随机均匀分布。它们不仅大量分布于 基因的间隔区和内含子中，而且还分布于基因的外显子和调控区(如启动子、增 强子)，真核生物平均每50-150 kb就存在一个微卫星位点，如在人类基因组中 每6 kb就有1个微卫星，禽类基因组中约89 kb出现1个微卫星。微卫星DNA 数目巨大，人类基因组中约有5X104-1X105个(CA)n重复序列，重复次数一般 为15-60次，重复单位相同，其长度一般小于200 bp，但也有的更长。每个特定位点的微卫星DNA均由两部分构成：中间的核心区和外围的侧 翼区。核心区含有一个以上称为“重复”的短序列，一般该重复单位的碱基对数 目不变，而串联在一起的重复单位数目
4、是随机改变的，如果用一种不切重复单位 的限制性内切酶把DNA分子切割成限制性片断，该限制性片断中位于核心区的外 围即是侧翼区。人群中不同个体可表现为侧翼区相同而串联重复单位的数目不 同；也可为有相同数目的重复单位但侧翼区大小不同，或者两者均不同。对那些 非微卫星DNA位点的DNA RFLP研究表明，每个位点的RFLP仅能检测到1个到 数个等位基因。因此，可以推论，微卫星 DNA 位点的侧翼区变异数也仅有少数几 个，这样人群中该特定微卫星位点的等位基因差异，主要应来自不同数目的串联 重复。此外，微卫星 DNA 还具有以下特点： 在正常人群中显多态性现象，即微卫星 DNA 拷贝数在人群中是可变的；
5、 具有遗传连锁不平衡现象； 均可被转录，有些编码蛋白质，而另一些则不编码蛋白质 ( 位于非转译区的 5和3端)； 属于不稳定的 DNA 序列，其数目在某些遗传病中有扩增现象，而这种扩增 并非是减数分裂的重组造成，扩增可发生在减数分裂过程中，由一代传递 给另一代，也可发生在有丝分裂中，导致嵌合体形成。与成熟人体细胞比 较，微卫星DNA在胚胎时期有丝分裂很不稳定； 在不同基因位点上的微卫星 DNA 的重复顺序可以不同，也可以相同。从 理论上说，一种微卫星重复顺序的寡核苷酸探针可确定人类基因内约 20个不同 位点的微卫星，假设有 20 种微卫星重复顺序的探针，即可对人类任何基因组位 点进行定位，应用
6、前景极大。2 微卫星的类型及其分布研究表明(AC)n是真核生物包括人在内的生物基因组中含量最丰富的 散在分布重复序列。Weber检测了人类基因组中100多个重复数不同的(AC)n序 列，利用一套精细的分类方式将微卫星分为三类：完全重复序列，指在(AC)n重复中没有其他碱基分散于其中，其比例占总重 复序列的 64%；不完全重复序列，指两个或多个不间断的重复(AC)n被连续的非重复碱基序 列隔开，这些间隔区不超过三个，含量约为 25%；复合序列，指两类或两类以上的串联重复单位由不多于3个连续的非重复碱 基分隔开，但不中断的重复单位的重复数大于5，其比例为11%。不同生物体的 基因组中三种序列的比例
7、不尽相同，在猪的基因组中三者的含量分别为 71%、19% 和 10%。3 微卫星的功能微卫星 DNA 功能尚不完全清楚，目前普遍认为充当基因重组的热点，是 基因重排和变异的来源，微卫星DNA通过改变DNA结构或通过与特异性蛋白质结 合而发挥其基因调控作用。4 微卫星 DNA 的检测4.1 DNA指纹图谱法：根据不同位点的微卫星DNA可有相同重复顺 序单位的特点，用一种核心重复顺序作为探针，可检测到许多不同位点的微卫星， 经 Southern Blot 转移杂交，放射自显影在 X 光胶片上显现 DNA 指纹图谱，该 图谱不表示任何特定微卫星位点，而是许多微卫星位点的集合状态。每个个体至 少可显示
8、18 条以上的带纹，并且有高度的个体指导性。家系分析表明，该指纹 以孟德尔遗传方式传递，如果用不同位点微卫星DNA核心重复顺序制作核苷酸探 针，可得到不同的DNA指纹，因此该法在法医学上有很高的应用价值。4.2 变性聚丙烯酸胺凝胶电泳检测法： 根据微卫星位点两端的互补序列合成引物，然后用 PCR 扩增出长度不同的片段，这种PCR扩增的不同长度片段用高分辨的变性聚丙烯酞胺凝胶电泳来区分， 最后用 AgNO3 染色得到结果。该法分辨率、灵敏度明显高于琼脂糖电泳、放射自显影等方法，且操作时间 短，在聚丙烯酞胺中加入甲酸胺和尿素还可以减少异源双链的形成，该技术在遗 传病诊断、基因定位、尤其在法医学上日
9、益广泛。4.3 毛细管电泳法(capillary electrophoresis, CE):毛细管电 泳法(CE)是近几年崛起的高效快速的分离分析技术，此法先以PCR扩增含有微卫 星位点的目的DNA片段，然后利用CE进行分离分析。此法最主要的优点是快速、 微量、分辨率高、重复性好、易于定量和自动化。 CE 能在 20 min 内分离长至 几千KB的DNA片段，对于外显子大小的DNA片段，其分辨率可达1 bp。该技 术目前已广泛应用于核酸定量、基因突变的检测、遗传病的诊断等，它与 PCR 和其它技术相结合将逐渐取代传统的琼脂糖和聚丙烯酞胺电泳。随着激光检测仪 的引入，将会进一步提高分析灵敏度及分
10、辨率。4.4 PCR-RFLP或ASO检测法：以特定微卫星位点侧翼区互补序列合 成引物，进行微卫星 DNA 位点的扩增，然后再用该位点的特异性探针进行 RFLP 检测或用该等位基因特异的寡核苷酸探针(ASO)进行印迹杂交、放射自显影，该 法特异性强、可靠。实验表明，该法在法医学上，尤其是罪犯的刑事鉴定方面的 应用是成功的。当微卫星DNA位点由一个或数个重复顺序的差异而产生不同的等 位基因时，这种差异用传统的琼脂糖凝胶电泳和印迹杂交无法分辨，尤其在DNA 片段很大而核心重复顺序很短的情况下，更无法分辨，采用该法检测，则可得到 满意的结果。4.5多重PCR微卫星荧光标记全自动基因组扫描：多重PCR
11、技术是指在同一 PCR 反应体系内对同一标本采用多种引物同时进行扩增，由 Perkin-Elmer 公司推出的微卫星荧光标记全自动基因分型技术已被普遍采用， 利用FAM、TET和HEM 3种不同颜色的荧光染料标记微卫星DNA引物，可以将多 种不同荧光标记和不同扩增片段的PCR产物在同一加样孔中电泳，并且可将待测 PCR产物与DNA内在分子量标准同时上样，通过顺序凝胶电泳，用GENESCAN(672) 软件进行图像分析，精确计算出微卫星等位基因片段大小。本法具有产量高、成 本低、快速简便等优点，显示了广阔的应用前景。5技术路线建立DNA文库，筛选鉴定微卫星DNA克隆，然后测定这些克隆的侧翼序列，
12、 设计特异性引物来扩增SSR序列。后经聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色，通过比较谱 带的相对迁移距离，便可知不同个体在某个SSR座位上的多态性。6实验流程从有关数据库(GenBank, EMBL DDBJ等)或文章中查询!构建基因组文库，筛选SSR位点一获得引物一使用近缘种的引物!PCR扩增!凝胶电泳!数据处理图 膀胱移行细胞癌的微卫星不稳定性分析上方数字为病人编码；N :正常对照（即自体淋巴细胞）；T:肿瘤组织图 银染 PCR-SSCP 检测正常和肿瘤组织 DNA 微卫星 DNA 不稳定性 A、B、C、D 分别代表 D2S119、D5S107、D2S123 和 D17S250 位点 MSI 情况；病例 11T、57T、9T和25T（箭头所示）肿瘤组织与正常对照组比较出现了 DNA单链泳动带的位移； N:正常组织；T：肿瘤组织M：标准DNA, N：正常组织，T：癌组织图 结直肠癌 Rb 微卫星 DNA 不稳定性
