植物生理指标测定

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1、实验22过氧化物酶活性的测定过氧化物牌是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生 长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这 种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握常 用的测定过氧化物酶的方法一愈创木酚法。一、原理在过氧化物酶（peroxidase）催化下,H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470m处有 最大光吸收，故可通过测470 nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料马铃薯块茎。（二）仪器设备722型分光光度计，离心机，研钵，容量瓶，量筒，试管

2、，吸管。（三）试剂（1）0.05 mol/L.pH5.的磷酸缓冲液。（2）0.05 mo/L愈创木份溶液。2%H202。（4）20%三氯乙酸。三、实验步骤（一）酶液的制备取5.0g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。 将匀浆液全部转人离心管中，于3000g离心10 min,上清被转人25 mL,容量瓶中。沉淀用5 mL 磷酸缓冲液再提取两次，上清液并人容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。（二）过氧化物酶活性测定酶活性测定的反应体系包括：2.9 mL.0.05 mol/L磷酸缓冲液；1.0ml.2%H2O2 ； 1.0mL.0.05mol/L愈创木面和0.1mL

3、酶液。用加热煮沸5min的酶成为对照，反应体系加人酶 液后，立即于37C水浴中保温15min.然后迅速转人冰浴中，并加人2.0ml.20%三氯乙酸终止 反应，然后，过虑（或5000xg离心10min）,适当稀释.470mm波长下测定吸光度。四、结果计算以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（u）。过氧化物酶活性二仝仝江u/ （g.min）xvsxo.oixt式中:AA47o为反应时间内吸光度的变化:W为马铃薯鲜重.g； t为反应时间，mins； VT 为提取酶液总体积，ml； Vs为测定时取用酶液体积，mL。实验24超氧化物歧化酶（SOD ）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）一、原

4、理超氧物歧化酶（Superxide dismtae, SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离 子自由基（02的酶，它催化下列反应：2O2 +2H+ * H2O2+02反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在 有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生 02,02可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560m处有最大吸收。而SOD可清除02， 从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活 性愈高。据此可以计算出酶活性

5、大小。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料水稻或小麦叶片。（二）仪器设备分光光度计，高速台式离心机，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管，荧光灯。（三）试剂的配制（1）0.05mol/L 磷酸缓冲液（PBS, pH7.8）：A 母液：0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：取 Na2HPO412H2O （分子量 358.14） 71.7g；B 母液：0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取 NaH2PO4.2H2O （分子量 156.01） 31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取 A 母液（Na2HPO4） 228.75ml，B 母液（NaH2PO4）

6、 21.25ml， 用蒸馏水定容至1000ml。加入10gPVP （聚乙烯吡咯烷酮）（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。（3）100 u mol/L EDTA-Na2 溶液：取 0.03721g EDTA-Na2 用磷酸缓冲液定容至 1000ml。（4）20M核黄素溶液：取0.00753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。（5）750 u mol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml避 光保存。三、实验步骤酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的

7、研钵中，加1ml磷酸 缓冲液在冰浴下研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml。取1.5-2ml于1000r/min下离心20min, 上清液即为SOD粗提液。提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4C的冰箱里。显色反应 取试管（要求透明度好）4, 2为样品测定管，2为对照管，按表39-1加入各溶 液。混匀后将1支对照管置于暗处其他管于4000lx日光反应20min （要求各管受光情况一致，反 应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。表39-1各溶液加入量试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met 溶液0.313mmol750

8、 u mol/L NBT 溶液0.375 u mol100 u mol/L EDTA-Na2 液0.310 u mol20 u mol/L核黄素0.32.0 u mol酶液0.052支对照以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其它各管560nm波长下的消光度值，已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按 下式计算SOD活性：SOD总活性=（AckAE竺0.5xWxVtxAck式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位/mg蛋白表示；Ack为照光管的消光度值；AE为样品管的消光度值；V为样品

9、液总体积（ml）； Vt为测定时样品用量（ml）；W为样鲜重，go苯酚法测定可溶性糖一、原理植物体内的可溶性糖是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理 是:糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛（分子式见蒽酮法）能与苯酚缩合成一种 橙红色化合物，在10- 100 mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485m波长下有最 大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定吸光度。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，试剂便宜，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的 颜色可稳定160 min以上。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料新鲜的植物叶片。（二）仪

10、器设备分光光度计，水浴锅，刻度试管，刻度吸管。（三）试剂（1） 90%苯酚溶液：取90g苯酚（AR）,加蒸馏水10mL溶解，在室温下可保存数月。9%苯酚溶液。取3 ml 90%苯酚溶液，加蒸馏水至30 ml,现配现用。（3）浓硫酸（比重1.84） o（4）1%蔗糖标准液。将分析纯蔗糖在80 C下烘至恒重，精确称取1.000g加少量水溶解，转人 100 mL容量瓶中，加人0.5 m浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度线。100 ug/蔗糖标准液。精确吸取1%蔗糖标准液1mL，加入100mL容量瓶中，加水至刻度。三、实验步骤1标准曲线的制作取20mL刻度试管11支，从010分别编号，按表2-32-3加人溶液

11、和水。表2-32-3苯酚法测可溶性糖绘制标准曲线的试剂量试剂管号01、23、45、67、89、10100ug.L-i 蔗糖液/mL00.20.40.60.81.0水/mL2.01.81.61.41.21.0蔗糖量/ug020406080100然后按顺序向试管内加人1mL9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以520S加人5 mL浓硫酸,摇匀。比色液总体积为8mL,在室温下放置30min,比色。然后以空白为参比，在485nm波长 下比色测定吸光度，以糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准曲线方 程。2可溶性糖的提取取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10-0.30g，共3份

12、（或干材料），分别放 人3支刻度试管中，加入5-10mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30 min（提取2次）， 提取液过滤入25mL容量瓶中，反复漂洗试管及残渣，定容至刻度。3测定吸0.5ml样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL，步聚与制作标准曲线相同，按 顺序分别加人苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定吸光度。由标准曲线查出糖的含量。四、结果计算按下式计算测试样品的糖含量从标准曲线查的糖的含量X提取液体积X稀释倍数可溶性糖含量二一 测定用样品液的体积X 100%106X样品重量实验53脯氨酸含量的测定在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline,Pro）的含量

13、显著增 加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多 的脯氨酸，因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极 强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在 低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生 理指标。一、原理当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚 三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中。色素的深浅即 表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色测定吸光度，从标准曲线上查出(或用同归方 程

14、计算)脯氨酸的含量。二、材料、仪器设备及试剂(-)材料待测植物(水稻、小麦、玉米、高梁、大豆等)叶片。(二) 仪器设备分光光度计，研体，小烧杯，容量瓶，大试管，普通试管，移液管，注射器，水浴锅，漏 斗，漏斗架，滤纸，剪刀。(三) 试剂酸性茚三酮溶液:将1.25g茚三酮溶于30mL冰醋酸和20ml 6mol/L磷酸中.搅拌加热 (70C)溶解，贮于冰箱中。(2) 3%磺基水杨酸:3g磺基水杨酸加蒸馏水溶剂解后定容至lOOmL(3 )冰醋酸。(4)甲苯。三、实验步骤1. 标准曲线的绘制(1) 在分析天平上精确称取25 mg脯氨酸，倒人小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒人250 mL容量瓶中，加蒸馏

15、水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100ug。(2) 系列脯氨酸浓度的配制。取6个50mL容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5 mL、1.0mL、1.5 mL、2.0mL、2.5mL及3.0mL用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1 ug/mL、 2 ug/mL、 3 ug/mL、 4 ug/mL、 5 ug/mL 及 6ug/mL。(3) 取6支试管，分别吸取2mL系列标准浓度的脯氨酸溶液及2mL冰醋酸和2 mL酸性茚 三酮溶液,每管在沸水浴中加热30 min。(4) 冷却后各试管准确加人4mL甲苯，探荡30s，前置片刻，使包素全部转至甲苯溶液。(5) 用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照， 于520 nm波长处进行比色。(6) 标准曲线的绘制:先求出吸光度值(y)依脯氨酸浓度(x)而变的回归方程式，再按回归 方程式绘制标准曲线，计算2 mL测定液中脯氨