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1、杨梅素和二氢杨梅素的高效分离纯化大 摘 要本研究以藤茶（显齿蛇葡萄）为原料致力于易于工业化生产的二氢杨梅素、杨梅素的分离纯化条件研究。建立和优化了二氢杨梅素的结晶重结晶条件，获得了较高纯度的二氢杨梅素和杨梅素。在此基础上，建立了高效液相色谱法测定杨梅素、二氢杨梅素的操作条件和藤茶总黄酮的测定方法。藤茶是一种非常古老的中草药资源、类茶植物资源和药食两用植物资源，其原植物为葡萄科蛇葡萄属的显齿蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata(Hand-Mazz) W.T.Wang）。其性凉，具利尿，消炎，清热解毒，散瘀破结,祛风除湿等功效，能医治肺痈、肠、瘰病、痈症肿痛、跌打、风湿、烫伤、
2、肝炎、慢性肾炎、小便涩痛等疾病，并可治感冒、咽喉肿痛、胃热呕吐等症。藤茶主要成分为二氢杨梅素和杨梅素等黄酮成分。二氢杨梅素基本性质为白色针状结晶，mp: 245246,易溶于热水、热乙醇、丙酮、甲醇，微溶于水、醋酸乙酯，难溶于氯仿、石油醚。显色反应为盐酸-镁粉反应呈玫瑰红色，三氯化铁反应呈紫黑色，与三氯化铝反应呈强黄绿色荧光；-萘酚反应阴性；与锆盐-柠檬酸反应鲜黄色不褪。杨梅素基本性质为黄色结晶，mp：324326，溶于甲醇、乙醇、热水，微溶于水，难溶于氯仿、丙酮、石油醚。显色反应为盐酸-镁粉反应呈玫瑰红色，与FeCl3乙醇液反应呈墨绿色，与AlCl3反应呈强黄绿色荧光，-萘酚反应呈阴性，与N
3、aOH 反应呈黑绿色，UV(MeOH)：375.0nm，255.0nm。贵州藤茶黄酮含量可高达40%以上，藤茶黄酮的主要成分为二氢杨梅素（Dihydromyricetin，DMY）和杨梅素（Myricetin, MYR），美国FDA已将杨梅素广泛应用于医药、食品、保健品和化妆品；而二氢杨梅素具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、消炎等多种功效，广泛应用于治疗呼吸道感染、酒精中毒的中成药制剂并已在制备抗白血病及鼻咽癌药物的应用领域取得了发明专利；是保肝护肝，解酒醒酒的良品，主要作为医药原料药并做为一类新药准备进入临床试验。研究了藤茶总黄酮的测定方法，以二氢杨梅素为对照品，在291 nm测定吸收
4、度，获得标准曲线的线性回归方程为：y= 0.0441x+ 0.034，相关系数： R2=0.9992，建立了藤茶总黄酮的测定方法，用该法测定藤茶总黄酮含量，比用芦丁作标样测定结果更准确和符合实际，测定6月初采自贵州梵净山的藤茶中总黄酮成分含量达43%。杨梅素和二氢杨梅素在结构上仅存在2,3位双键的差异，现有文献中还没有采用常规溶剂法同时将二者纯化出来的报道。本实验经过多个方案综合，结合二者极性以及对丙酮溶解度的差异，先采用水煎煮法提取总黄酮，即称取干燥的藤茶茎叶100g，粉碎后加热煎煮提取两次，滤液放置在0-4环境下静置过夜，待析出黄色沉淀后，用乙醇溶解，去杂精制。然后减压回收乙醇，干燥黄色块
5、状物，得粗黄酮。接着用丙酮作为提取溶剂回流提取总黄酮，得到二氢杨梅素的丙酮提取液，回收丙酮，黄色浓稠物用水进行重结晶，经多次重结晶后可得具有细针状的高纯度二氢杨梅素，并且在重结晶加热过滤操作中，在滤纸上存有大量黄绿色物质，将其收集干燥后保存。丙酮提取后的不溶性残渣采用乙醇-水（1:1）进行回流提取，将提取液进行浓缩，静置数日可得黄褐色沉淀。经提取分离后得到三个分离纯化产物，分别将其在甲苯-乙酸乙酯-甲酸10:8:5)和甲苯-乙酸乙酯-甲酸（6:10:1)的展开剂中进行展开，与杨梅素和二氢杨梅素标准品斑点和Rf值比较，白色针晶所呈斑点与二氢杨梅素对照品斑点一致，同样对1%FeCl3乙醇液显紫黑色
6、，在甲苯-乙酸乙酯-甲酸（10:8:5）展开剂中，二氢杨梅素对照品Rf值为0.37，白色针晶Rf值为0.38，在甲苯-乙酸乙酯-甲酸（6:10:1）展开剂中，二氢杨梅素对照品Rf值为0.59，白色针晶Rf值为0.57，白色针晶在两种不同比例的展开剂中所呈斑点单一；黄绿色物质，黄褐色沉淀和杨梅素对照品所呈斑点一致，遇1%FeCl3乙醇液显墨绿色，慢慢变为棕黑色，尽管斑点所显颜色与二氢杨梅素所显颜色有所相似，但对比之下，仍可区分。在不同比例的甲苯-乙酸乙酯-甲酸展开剂中，黄绿色物质所呈斑点单一，黄褐色沉淀中除有与杨梅素对照品相同高度斑点外，还有一个低于杨梅素对照品高度的斑点，且该斑点对1%FeCl
7、3乙醇液显紫黑色，高度与二氢杨梅素对照品高度一致。在甲苯-乙酸乙酯-甲酸（10:8:5)展开剂中，杨梅素对照品Rf值0.54，黄绿色物质Rf值为0.54，黄褐色沉淀Rf值为0.55和0.40，在甲苯-乙酸乙酯-甲酸（6:10:1）展开剂中，杨梅素对照品Rf值为0.60，黄绿色物质Rf值为0.60，黄褐色沉淀Rf值为0.61和0.49，盐酸-镁粉反应为鉴定黄酮类化合物常用的反应。经分离所得的产物经盐酸-镁粉反应后均呈紫红色。经薄层色谱和盐酸-镁粉显色反应以及前已述及的相关文献报道，可以初步鉴定出白色针晶为二氢杨梅素，黄绿色物质和黄褐色沉淀为杨梅素，但黄褐色沉淀中主要还含有二氢杨梅素杂质。鉴于二氢
8、杨梅素样品和经重结晶操作首次得到的杨梅素样品在色谱行为中斑点单一，说明其纯度较高，故用高效液相色谱分别测定白色针晶物和黄绿色物质中二氢杨梅素和杨梅素的含量。用HPLC测定所得产物纯度，在如下色谱条件下：a 二氢杨梅素 固定相：Nava-pakC18柱，流动相：甲醇-水-磷酸（24:76:0.1) 紫外检测波长：294nm 流速：A泵0.24mL/min B泵0.76mL/min 总流速1.0mL/min 进样量：10L，柱温：30b 杨梅素 固定相：Nava-pakC18柱，流动相：甲醇-水（40:60，磷酸调pH) 紫外检测波长:254nm 流速：A泵0.40mL/min B泵0.60mL/
9、min 总流速1.0mL/min 进样量：10L，柱温：30得到二氢杨梅素标准品保留时间为8.862min，峰面积为497388，二氢杨梅素样品保留时间为8.882min，面积446986；配制20g/mL的/杨梅素标准品和样品溶液经测定后，得到杨梅素标准品保留时间为6.117min，峰面积350885，杨梅素样品保留时间5.933min，峰面积306557。利用峰面积之比等于浓度之比可以算出二氢杨梅素样品的纯度为89.87%，杨梅素样品的纯度为87.37%。二氢杨梅素标准品和样品的保留时间大致相当，杨梅素标准品与杨梅素样品的保留时间相差不大。以上实验结果说明，通过水提醇溶法提取总黄酮，然后分
10、别用丙酮、乙醇-水(1:1)提取分离二氢杨梅素和杨梅素，重结晶纯化后得到二氢杨梅素和杨梅素的实验方案切实可行，实验首次通过重结晶过滤操作得到的杨梅素样品含量为87.37%，这在现有文献中并无报道。用本方法可同时分离纯化获得杨梅素和二氢杨梅素，方法简单经济，操作容易、安全，获得的杨梅素和二氢杨梅素纯度高，经实验室放大实验验证工艺可行，为杨梅素和二氢杨梅素的高效分离纯化和工业化生产提供参考。杨梅素和二氢杨梅素的高效分离纯化摘 要贵州藤茶黄酮含量可高达40%以上，藤茶黄酮的主要成分为二氢杨梅素（Dihydromyricetin，DMY）和杨梅素（Myricetin, MYR），美国FDA已将杨梅素广
11、泛应用于医药、食品、保健品和化妆品；而二氢杨梅素具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、消炎等多种功效，广泛应用于治疗呼吸道感染、酒精中毒的中成药制剂并已在制备抗白血病及鼻咽癌药物的应用领域取得了发明专利；是保肝护肝，解酒醒酒的良品，主要作为医药原料药并做为一类新药准备进入临床试验。由于二氢杨梅素和杨梅素结构性质相近，在现有文献及专利中还没有采用常规溶剂提取法和重结晶纯化法同时将两者分离出来的报道。在参考杨梅素和二氢杨梅素各自现有的分离方法结合实验条件，采用水提醇溶法得总黄酮，再用丙酮对黄酮粗粉进行索氏提取分离二氢杨梅素，然后用乙醇-水（1:1）提取不溶性残渣分离杨梅素，最后用水重结晶法分别对
12、两者进行纯化，首次通过二氢杨梅素的重结晶过滤操作得到纯度较高的杨梅素，经高效液相色谱测定，杨梅素纯度为87.37%，二氢杨梅素纯度为89.87%，这在现有各种文献中并无报道。研究了藤茶总黄酮的测定方法，以二氢杨梅素为对照品，在291 nm测定吸收度，获得标准曲线的线性回归方程为：y= 0.0441x+ 0.034，相关系数： R2=0.9992，建立了藤茶总黄酮的测定方法，用该法测定藤茶总黄酮含量，比用芦丁作标样测定结果更准确和符合实际。用本方法可同时分离纯化获得杨梅素和二氢杨梅素，方法简单经济，获得的杨梅素和二氢杨梅素纯度高，经实验室放大实验验证工艺可行，为杨梅素和二氢杨梅素的高效分离纯化和
13、工业化生产提供参考。关键词：藤茶；二氢杨梅素；杨梅素；高效分离纯化；新方法；总黄酮；测定An Efficient method for Separation and Purification of Dihydromyricetin and Myricetin from Ampelopsis grossdentataAbstract The content of flavonoids from Ampelopsis grossdentata in Guizhou province can be up to 40%, whose main components are dihydromyricet
14、in and myricetin. Myricetin has been widely used in medicine, food, health care products and cosmetics by U.S. FDA; dihydromyricetin has many effects, such as getting rid of free radical, antioxidant, antithrombotic, anti-tumor, anti-inflammatory, has been widely used to treat respiratory tract infe
15、ctions, alcoholism as Chinese medicine formulations, and has obtained patents in the preparation of anti-leukemia and nasopharyngeal cancer drug. They are good for protecting liver, alleviating a hangover and promoting awake, mainly used as a pharmaceutical raw materials and as a class of drugs read
16、y to enter clinical trials.As dihydromyricetin and myricetin have similar structure properities, its rarely reported dihydromyricetin and myricetin were obtained by conventional solvent extraction and recrystalization at the same time in current scientific literature and patents. After consulting current separation methods o
