微尺度酶反应器

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1、具有固定化胰蛋白酶金纳米粒子的微尺度酶反应器有效提高蛋白质的消化速率应用微型样品处理设备最近几年已经在生物分析和蛋白质组学相关研究中经历了快速 的进步。已经报道了几种基于芯片和毛细管微流体系统及其所需的功能改性的筹备技 术。1，2利用微流体装置可方便地处理非常小的样本量，低试剂消耗，并提供高表 面积和表面与体积比。微量样品处理设备应用于各种研究领域，如化学分析，动力学 研究，以及生物分析的研究中3-5在基于MS的蛋白质组学，酶消化是在蛋白质及其翻译后修饰的识别的关键步骤之一。 6然而，这通常是在分析工作流程中的最慢的步骤。因此，合适的设备和能够高效迅 速的蛋白质消化的方法的发展，已成为相当大的

2、兴趣的区域。对不同类型的固定相， 如石柱，微粒和纳米粒子和样品转移毛细管内表面的蛋白水解酶的固定化呈现出可喜 的成果7-9。在另一方面，不同的固定相的制备和应用相关的问题可能会带来一些挑 战，如整体固定相涉及耗时的制作过程。同样地，基于颗粒的载体通常涉及多步合成， 并需要延长蛋白质的消化的温育时间。10因此，为了加速消化，如微波照射等技术 已被采用，11，将进一步复杂化的实验装置。另外，包括固定化酶明渠微反应器已经作为一个有前途的替代方案，在流量提供了最 小的限制。Krenkova等通过胰蛋白酶和胃蛋白酶的耦合到熔融石英毛细管内壁制 备开口的管状酶固定化反应器中。2 Stigter等。报道一个

3、基于氨基改性和羧基改性 葡聚糖开口的管状胰蛋白酶反应器的开发。9后来，同组的制备了葡聚糖改性熔融石 英毛细管胃蛋白酶固定化反应器进行蛋白质的在线消化。12 葡聚糖水凝胶对毛细 管壁进行涂层以加载较高量的胰蛋白酶，从而提供了相比于平坦表面更好的酶/载体相 互作用。由于其独特的特性，如纳米颗粒表面积和表面与体积比高，提供了用于各种应用的巨 大潜力。金纳米颗粒（的GNP），特别是可以作为用于药物递送，生物传感和生物 成像目的的稳定和无毒性的载体。13在分离科学中GNP的使用也越来越大并且最近 已经在评估。14为了蛋白质的消化，刘等人。用含有胰蛋白的酶聚（二甲基二烯丙 基氯化铵）/GNP多层膜进行聚对

4、苯二甲酸乙二醇酯片的微通道的涂层，制造微流体酶 反应器，用于蛋白质的消化。15类似地，Hinterwirth和同事报道胰蛋白酶通过使用 各种长度的不同间隔件生物耦合到GNP。16酶活性的不同变量的影响进行了研究， 如GNP的尺寸和间隔物的性质和长度。将蛋白质样品和结合GNP的胰蛋白酶保温不同 的时间间隔来完成水解。我们在此第一次报告，具有固定化胰蛋白酶的GNP的开放管状微反应器，能够以流过 方式进行蛋白质消化的制备。为获得附着在熔融石英毛细管的内壁上的胰蛋白酶固定 化的GNP，采用了以下两种方法。熔融石英毛细管（内径50p m和外径为360 p m,100厘米长），用水洗涤，并用1M 的NaO

5、H溶液以1微升/分钟的流速处理2小时。水洗涤毛细管30分钟后，用泵在相 同流速加入0.1M的HCl溶液1小时。接着，分别用水和丙酮清洗毛细管30分钟，并 在氮气流中干燥2小时。将3 -（三甲氧基硅基）-1 -丙硫醇和甲醇（1:4，体积/体 积），1微升/分钟冲洗毛细管4小时并静置过夜。接着，将毛细管用甲醇洗涤，并在 氮气流中干燥。这些毛细管被进一步用于微反应器的制备。在第一个策略中，2.5毫克胰蛋白酶溶于250 pL含有50mM苯甲眯的100mM磷酸钠 缓冲液（pH 7.0 ），和750 pL的GNP胶体溶液加入到该溶液中，充分混合并在4 保温过夜.GNP上胰蛋白酶的吸附用紫外可见分光法确认。

6、未缀合的GNP表现出在 523纳米有最大吸收，而在胰蛋白酶共轭的GNP的情况下，在峰变宽的同时，发现一 个吸光度红移，在597纳米（SI十图S1）的最大吸光度。这种转变可以归因于吸附胰 蛋白酶后，在颗粒直径的变化，引起的GNP的等离激元的属性的改变。17生物结 合胶体溶液充分混合，并以1微升/分钟的流速通过预处理的含有表面巯基的毛细管过 夜。最后，该微反应器用25 mM乙酸铵缓冲液（pH 6.9 ） 1微升/分钟的流速冲洗2 小时。微型反应器由两端密封，并储存于4。仁这种反应器将被称为在后来的讨论中 微反应器凡方案1 （ a）示出了微反应器A的制备方案1。 （-）（A）（微反应器B ）吸附胰蛋

7、白酶的GNP微反应器的制备（微反应 器A ）与（B ）通过PEG间隔器的制备胰蛋白酶固定化GNP微反应器（微反应器B ）。在第二个策略，未缀合的GNP通过含有表面硫醇基的预处理的熔融石英毛细管，流速 为1微升/分钟持续8小时并静置过夜。用1微升/分钟的水冲洗30分钟后，O-（巯基 乙基）的35 mM的溶液的流速洗涤后，O- （2 -羧基乙基）七乙二醇（PEG硫醇酸） 的甲醇溶液通过毛细管以1微升/分钟的流速冲洗3小时。然后用甲醇洗涤毛细管，随 后用在甲醇中在相同的流速200mM的N-乙基-N- （ 3 -二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐 酸盐和350mM的N-羟基琥珀酰亚胺混合物，处理4小时。用甲醇

8、冲洗后，水和 100mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0 ）洗涤，胰蛋白酶以2.5毫克/毫升的浓度溶解于 100mM磷酸缓冲液（pH 7.0 ）溶液，0.5微升/分钟通过毛细管过夜。最后，该微反应 液用25mM乙酸铵缓冲液（pH 6.9 ），密封，并储存于4 C。该反应器将在即将进 行的讨论可以称为微反应器乙。方案1 （b）描述的微反应器B的制备为了确认的修改协议的成功，石英载玻片的表面形貌根据适用的微反应器制备的协议 进行改进，用非接触模式操作，用原子力显微镜（AFM ）进行分析。进行了电子显微 镜（SEM ）扫描是为了确认GNP附着到了熔凝硅石毛细管（图1）的内壁上。随机在 几个不同的位置切割制

9、备的毛细管进行扫描电镜测试。另外，能量色散乂射线光谱法 确认的GNP的在毛细管表面（SI十图S3 ）的存在。这些表征技术证实了成功的表面改 性。图1。该反应器A（A ）和微反应器B（ B ）的扫描电子显微镜图像。（一）。一个小的模型蛋白，细胞色素c，被用来测试所制备的微反应器的蛋白水解效率。该蛋 白溶解在25mM乙酸铵缓冲液（pH 8.5 ）至终浓度分别为5和1 pM。在环境温度下 以1 p L/ min的流速将样品溶液用泵送到反应器，消化是通过流动的方式进行。肽组 分收集在Eppendorf管中，并且组分等分的20微升试样用乙腊/水/乙酸（49.5:49.5:1.0 , V / V）稀释，并

10、随后使用电喷射离子化傅立叶变换离子回旋共振 （ESI FT - ICR ）质谱（有关详细信息，请参阅SI十）分析。胰蛋白酶直接吸附到GDP上的微反应器A，产生了 29肽，相当于95 %的序列覆盖率（SC ）。在另一方 面，在其中胰蛋白酶通过阻隔器固定的微型反应器B产生了 94 %序列覆盖率，具有确 定的25个独特的肽段。为了进行比较，细胞色素c在1 : 40 （重量/重量）酶与底物 的比率在37 进行5小时溶液消化，这产生了 31胰蛋白酶肽，相当于96 %序列覆 盖率。我们观察到用在1微升/分钟的流速运行两个微型反应器，1p M的细胞色素c完 全消化。这是与在溶液中消化相比较，其中未消化的蛋白

11、质仍清楚地观察到（质谱图中的SI十）。 所使用毛细管尺寸的流速换算成只有118秒的柱上消化时间，这相比于在溶液中消化（5小时）明显更快。使用吉祥物搜索引擎数据库中搜索得到MOWSE得分在160-226 正确的蛋白质（CYC_HORSE ）的范围内进一步测试了制备微反应器消化蛋白的水解能力，a-酪蛋白（5p M）, 6-酪蛋白（5p M ）和6-乳球蛋白A（5pM ）单独溶解在乙酸铵缓冲液（pH 8.5）（见SI十了解详细信 息）。两个酪蛋白消化不进行预处理，而6-乳球蛋白A在消化之前在95进行15分 钟变性。所有蛋白被有效地消化，得到高的序列覆盖率（表1 ）。数据库搜索结果中 准确识别所有消化

12、蛋白质。用两个微反应器，细胞色素c和6-酪蛋白的消化近100% 序列覆盖率。在a-酪蛋白的情况下，较低的SC （和得分）是高度磷酸化的N-末端肽 （残基58-94 ）的完全抑制的结果。图2的a-酪蛋白通过微反应器A和B以及溶液消化获得的胰蛋白酶消化物与得到的ESI FT-ICR MS谱图。表1中。序列覆盖率，确定的胰蛋白酶肽的数目，MOWSE得分和观察通过两个微型反 应器和在溶液消化消化每种蛋白质最大错失裂解的数目 图2。同时使用微反应器和溶液消化a-酪蛋白的胰蛋白酶消化物的电喷雾傅立叶变换离 子回旋共振质谱图。测定之前消化的样品用溶剂MeCN/H2O/HOAc （ 49.5 : 49.5 :

13、 1.0 , V / V）稀释。对于峰值，见SI+表 S1 , S2 , S3和S4。表1给出了确定的胰蛋白酶肽的数目，最大SC和每个标准的蛋白质通过这两个微反应 器和在溶液中的消化的获得的数据库搜索得分值（MOWSE）的摘要。根据结果，在胰 蛋白酶固定化GNP微反应器，制备两种不同的策略，产生可比较的结果。蛋白质的消 化被从在溶液消化的情况下，5小时的温育时间加速至于该微反应器的情况下118s， 相当于150倍的消化速度。此外，碰撞诱导解离串联质谱（MS / MS）胰蛋白酶消化物中选择肽进行进一步鉴定。 图3两种微反应器，以及溶液消化的P-酪蛋白的C-末端胰蛋白酶肽18牛209（ 3 +离

14、子在m / Z970.5351）的碰撞诱导解离的MS / MS谱。B系列离子和y离子的进一步 证实这种肽。图3。阡酪蛋白的C末端的胰蛋白酶肽的碰撞诱导解离MS / MS图谱（M / Z 970.5351 , 3 +离子）（见，SI十图S7获取详细信息）184-209。该微反应器被反复使用进行蛋白质消化，并被认为是运作稳定，至少连续运行八次， 没有或酶的活性降低的很小。用两个微反应器经过多次反复消化之后，细胞色素C获 得的最小SC维持在 75%。微反应器A经过十次消化，观察到SC略有下降，而微反 应器B完全保持其性能。这表明，该反应器重复使用足够稳定。对消化也可再生重复 运行可观察到同一肽。此外

15、，不同消化蛋白质之间没有观察到肽的交叉污染亦无胰蛋 白酶的自身溶解的迹象。因此，这些类型的微反应器是溶液中消化希望的替代方案 中，提供具有成本效益和快速消化的性能，也可在与液体色谱分离结合使用。然而， 这些微反应器的长期运行和储存稳定性还需要进一步调查。总之，我们报告了使用GNP为载体微尺度酶固定化反应器的制备明确的程序。因为它 们具有对于所需功能的剪裁简单,GNP可用于制备毛细管型微型反应器的用于蛋白质 的消化，在蛋白质组学研究中应用。胰蛋白酶或是在附着于毛细管前直接前吸附在 GNP表面上，或可通过间隔器耦合，表面结合着GNP的毛细管内。除了胰蛋白酶，其 它蛋白酶，如胃蛋白酶，胰凝乳蛋白酶和Lys-C，可以以一个类似的方式固定化。此外, 这种方法可以扩展到开发双功能电发射器，同时作为用于在线消化蛋白质酶固定化微 反应器。