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1、实验五 食品中沙门氏菌的检验一、实验目的要求1 、 了解食品的质量与沙门氏菌检验的意义。2、掌握沙门氏菌的生物学特性。3、掌握沙门氏菌检验的生化试验的操作方法和结果的判断。4、掌握沙门氏菌属血清学试方法。5、掌握食品中沙门氏菌检验的方法和技术。二、原理沙门菌属是一大群寄生于人类和动物肠道， 其生化反响和抗原构造相似的革兰氏阴性杆 菌。种类繁多，少数只对人致病。其他对动物致病，偶尔可传染给人。主要引起人类伤寒， 副伤寒以及食物中毒或败血症。 在世界各地的食物中毒中， 沙门氏菌食物中毒常占首位或第二 位。食品中沙门氏菌的检验方法有五个根本步骤： 1 前增菌； 2 选择性增菌； 3 选择性 平板别离
2、沙门氏菌； 4 生化试验，鉴定到属； 5 血清学分型鉴定。 目前检验食品中的沙门氏菌是 按统计学取样方案为根底， 25g 食品为标准分析单位。三、试剂和仪器一最先准备的器材规格名称数量用途1、 500ml 广口瓶1个稀释样品2、 500ml 三角瓶1个制缓冲蛋白胨水3、 250ml 三角瓶8个制增菌液、培养基4、15 X 150mm 试管18 支制三糖铁培养基和PH7.2 尿素5、13 X 130mm 试管30 支制蛋白胨水等6 、 1ml 移液管5支7、 10ml 移液管2支8、直径为 90 mm 平皿12 套制 BS 、 SS 平板9、 250ml 量筒1支应灭菌的其它器材剪刀 1 把 不
3、锈钢汤匙1把称量纸适量应准备的培养基和试剂丄寺辛甘H卓培养基总量所用容器1. 缓冲蛋白胨水 (BP) ：1瓶225ml/ 瓶500ml 三角瓶2.氯化镁孔雀绿(MM)增菌液：1瓶100ml/ 瓶250ml 三角瓶3. 亚硒酸盐胱氨酸 (SC) 增菌液1瓶100ml/ 瓶250ml 三角瓶4. 亚硫酸铋琼脂 (BS) ：4皿1瓶60ml/ 瓶250ml 三角瓶5. SS 琼脂：6皿1瓶100ml/ 瓶250ml 三角瓶6.三糖铁琼脂：6支6ml/ 支40 ml15 X150mm试管7.尿素琼脂 (pH7.2) ：6支4ml/ 支25 ml15 X150mm试管8.蛋白胨水：6支2ml/ 支20
4、ml13X100mm试管9.氰化钾(KCN)培养基：6支4ml/ 支30 ml13X130mm 试管X130mm 试10.氨基酸脱羧酶试验培养基赖氨酸：6支1ml/ 支10 ml 13管11. 氨基酸脱羧酶试验培养基不含赖氨酸：6支lml /支10 ml 13 X 130mm试管12. 沙门氏菌因子血清： 多价血清 ；11 种因子血清。按 26 种用于初步分型； 57 种用于进 一步分型； 163 种用于详细分型。四、实验内容样品处理前增菌选择性增菌选择性平板别离生化学试验血清学试验鉴别结果报告第一天 样品处理和增菌培养一样品处理1、加工过的样品：冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。
5、称取检样 25g ，加在装有 225mL 缓冲蛋白陈水的500mL广口瓶内。固体食品可先应用均质器以800010000r/min打碎1min，或用 乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化，备用。2、未加工样品 ：鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。 各取 25g(25mL) 参加灭菌生理盐 水25mL，按前法做成检样匀液，备用。二、前增菌和增菌1 、加工过的样品 ：冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。接种操作：将混均匀的稀释样液放在36 土 1C培养4h(干蛋品培养1824h)；移取 10mL，转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液MM或四硫酸钠煌绿增菌液内，
6、于42C培养18 24h。同时，另取10mL，转种于100mL亚硒酸盐肮氨酸增菌液SC内。培养：于36 土 1 C培养1824h。2、未加工样品：鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。接种操作：取25mL匀液，接种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液MM或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42 C培养24h ；另取25mL接种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液SC内培养操作：于36 土 1 C培养1824h。第二天 接种选择性平板进行别离培养接种操作：取前天增菌培养的增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸钮琼脂平板（BS）和一个DHL琼脂平板（或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板）。两种增菌液可同时划线
7、接种在 同一个平板上。培养操作： 于36 土 1 C分别培养1824h（DHL、HE、WS、SS）或4048h（BS），观察 各个平板上生长的菌落。第三天观察别离结果，从平板上挑取可疑菌落接种到：三糖铁琼脂、蛋白陈水、尿素琼脂（pH7.2）、氧化钾（KCN）和赖氨酸脱竣酶试验 培养基（一）、观察别离结果典型的沙门氏菌菌落形态如下：A、在HEKTOEN氏肠道菌HE琼脂上。菌落呈兰绿至兰色，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可呈现大的光泽黑色中心 或几乎全部黑色的菌落。B、亚硫酸钮BS琼脂 上。产硫化氢的菌落为 黑色，有时带有金属光泽，呈褐色，灰色或黑色。菌落周围的培养 基通常开始呈褐色，但伴随
8、培养时间的延长而变为黑色，并有所谓的晕环效应。C、SS琼脂上：无色半透明；产硫化氢菌株，有的菌落中心带黑色。二、五项生化试验接种操作：1、 接种 三糖铁琼脂：从选择性琼脂平板上，直接挑取2个或更多个菌落，分别接种 三 糖铁琼脂。用一空白培养基作对照试验。用灭菌接种针轻轻地接触每个菌落中心部位，接种TSI斜面，先在斜面上划线，再于底层穿刺。不需灼烧接种针，接种后面四项生化培养基。2、接种蛋白陈水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氧化钾（KCN）培养基和赖氨酸 脱竣酶试验。各 用一空白培养基作对照试验。接种三糖铁琼脂的同时，再接种 蛋白陈水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氧化
9、 钾（KCN）培养基和赖氨酸脱竣酶试验培养基及对照培养基各 1管。培养操作：于36 土 1 C培养1824h，必要时可延长至 48h。革兰氏染色与镜检：从平板上挑取可疑菌落进行革兰氏染色与镜检第四天 观察五项生化试验结果，判断沙门氏菌属性，做血清学试验一、观察五项生化试验结果1、在三糖铁琼脂内，符合沙门氏菌属种的反响结果见表1。表1 沙门氏菌属种在三糖铁琼脂内的反响结果斜面底层产气产硫化氢可疑为沙门氏菌属和种-+/-+沙门氏菌属+/-+沙门氏菌II-+-沙门氏菌属-+-伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时硫化氢（H2S）阴性的菌株可以排除，其他的反响结果 均有沙门氏菌的可能
10、，同时也均有不是沙门氏菌的可能。2、符合沙门氏菌属的五项生化试按表2判定结果，沙门氏菌属 五项生化试 的结果应符合A1、A2和B1，其他反响结果均 可以排除。表2 沙门氏菌属种生化反响初步鉴别表反响序号H2S靛基质尿素（pH7.2）氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶判定菌属A1+-+沙门氏菌属A2+-+沙门氏菌属少见B-+沙门氏菌属、1-甲型号副伤寒沙门氏菌属符合反响序号 含，为沙门氏菌属典型反响，判定为沙门氏菌属细菌。如尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）和赖氨酸脱羧酶试验三项中，有一项异常，按表 3可判定沙门氏菌:表3尿素(pH7.2)氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶判定菌属-甲型号副伤寒沙门氏
11、菌-+沙门氏菌W或V+-+沙门氏菌个别变体、二、血清学分型鉴定1、抗原的准备一般采用1.5%琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2.5% 一 3%）培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反响时，可挑取菌苔于ImL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.7%0.8%半固体琼脂平板的中央，候菌落蔓延生长时，在其边缘局部取菌检查；或将菌株通过装有0.3%0.4%半固体琼脂的小玻管12次，自远端取菌培养后再检查。2、O抗原的鉴定操作：用AF多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐
12、水中自 凝者为粗糙形菌株，不能分型。玻片凝集试验图被AF多价O血清凝集者，依次用04 ； 03、10 ； 07 ； 08 ； 09 ； 02和Oil因子血清做 凝集试验。根据试验结果，判定0群。被03、10血清凝集的菌株，再用010、015、034、019 单因子血清做凝集试验，判定E1 、 E2 、 E3 、 E4 各亚群，每一个 0 抗原成分的最后确定均应根据 0 单因子血清的检查结果， 没有 0 单因子血清的要用两个 0复合因子血清进行核对。不被 A F 多价 0 血清凝集者，先用 57 种或 163 种沙门氏菌因子血清中的 9 种多价 0 血清检查，如有其中一种血清凝集，那么用这种血清
13、所包括的 0 群血清逐一检查，以确定 0 群。每种多价 0 血清所包括的 0因子如下：0多价 1A ， B， C， D， E， F 群（ 并包括 6， 140多价 213 ， 16， 17， 18， 21 群0多价 328 ， 30， 35， 38， 39 群0多价 440， 41 ， 42， 43 群0多价 544， 45， 47， 48 群0多价 650， 51 ， 52， 53 群0多价 755， 56， 57， 58 群0多价 859， 60， 61 ， 62 群0 多价 963，65，66， 67 群五、思考题1 、 如何提高沙门氏菌的检出率？2、沙门氏菌在三糖铁培养基上的反响结果如何？解释这些现象？3、沙门氏菌检验有哪 5 个根本步骤？4、食品中能否允许有个别沙门氏菌存在？为什么？
