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1、胚胎干细胞的起源和同一性摘要胚胎干细胞在生物研究方面应用广泛，也作为研究哺乳动物早期 发育的模型，但是它们精确的起源却是备受争议。传统上认为它们来 源于植入前的胚胎，但这暗示着形成胚胎干细胞的细胞可能已经有发 育为原始生殖细胞命运倾向的外胚层细胞产生，它通过原始生殖细胞 系形成胚胎干细胞。根据最近的研究发现我们提出胚胎干细胞可以直接来源于早期的外胚层细胞，这些胚胎干细胞可以通过不同培养条件形成的两条不同路径出现。关键词：细胞，胚胎干细胞，同一性 简介多能性是小鼠胚胎内细胞团形成外胚层的首要要求。在合适的培 养条件下，内细胞团细胞可以在体外以胚胎干细胞的形式增殖。这些 细胞保持有重新进入一个胚胎
2、（形成嵌合体）的能力，使这些细胞发 育为成体的所有组织，包括生殖细胞系和俗称为幼稚多能细胞。多能 干细胞最初来源于小鼠睾丸的畸胎瘤。由于畸胎瘤相对其他组织而言 在生殖细胞系中更常见可以推断这些畸胎瘤起源于干细胞；小鼠的睾 丸瘤一般在出生后形成；在胎儿的睾丸小管中可以清晰的观察到初期 的瘤。随后发现多能性细胞系很难与胚胎干细胞区分开来，这些胚胎 干细胞来源于体外发育的小鼠重新编程的胚胎的原始生殖细胞。因 此，捕获幼稚多能细胞的机会之窗在发育过程中打开两次：第一次在 早期的外胚层而第二次在干细胞系。胚胎生殖细胞与胚胎干细胞的相似之处强烈暗示着胚胎干细胞 可能来源于那些已经有发育为原始生殖细胞倾向的
3、外胚层细胞。也有 假说称是原始生殖细胞促进培养植入前和植入后发育阶段的胚胎形 成外植体。在这个假说中，我们依据近来的发现猜想胚胎干细胞可能 通过两条途径得到外植体：直接来源于新形成的外胚层，它处于幼稚 多能状态；或者培养在进行遗传重编程的特定原始生殖细胞，使它们 重获多能性（图1）。eUnspedfiad early embryonic deiIIsHypo bl日就PGCa and EGCaMofuliaTrophectoderrnEarly epbla&t 日nd ESCs图1幼稚多能细胞来源在一定条件下分离小鼠的胚胎干细胞、胚胎生殖细胞和原始 生殖细胞。（A）体内发育过程。在囊胚后期的早
4、期外胚层（红色）出现幼稚多能细胞系和 受精后8.5天的原始生殖细胞（黄色）（B）体外培养到囊胚期的另一条产生幼稚多能细胞的 途径。红心代表早期外胚层分离胚胎干细胞的路径；黄心代表通过形成原始生殖细胞而发育 为胚胎干细胞的较长的路径。灰色箭头代表长期培养可能会得到胚胎干细胞或胚胎生殖细胞 的假说。图示大小不代表真实比例。幼稚多能性的出现 哺乳动物受精后产生一个发育为完整的胚胎的受精卵和形成胚外世系。受精卵经过几轮的卵裂之后产生均等的卵裂球，但是在囊胚 阶段，出现了两个在形态上和分子上存在明显差异的世系。滋养外胚 层的特征是上皮样特性和在其他特定标记中表达转录因子Cdx2 （尾 形同源框2），它主
5、要对胎盘发挥作用，然而内细胞团分化为上胚层（其他方面认为是原始的外胚层）和下胚层-通常被认为是原始内胚 层。至少在鼠胚植入阶段时上胚层和下胚层是完全不同的。每个都有 自己的分子特征。尤其上胚层表达转录因子Nanog而下胚层表达转 录因子Gata6和Gata4 （Gata结合蛋白6和4）（图2A）。上胚层身份 获得与雌鼠胚胎失活X染色体的再激活同时发生。X染色体的再激 活也是胚胎干细胞成功形成的标志，可能也算降低染色质在外胚层难 以建立幼稚多能状态难度的遗传学事件之一。外胚层形成时不要求内 胚层的分化；那些携带基因编码成纤维生长因子（Fgf） /Erk （Ephb2- 小鼠的基因组信息）通路元件
6、突变的胚胎，像Grb2 （生长因子受体 结合蛋白2），缺少内胚层但是有明显正常的外胚层。Fgf/Erk通路的 化学抑制剂完全抑制外胚层的发育，随后扩大外胚层（增殖）。用这 种方式处理的胚胎外胚层细胞并不能完全抑制细胞本来发育的潜力； 它们对正常的胚胎发生起作用，当注入宿主囊胚时形成功能性生殖细 胞。随后植入，啮齿动物的外胚层从球状细胞发育为杯状上皮。这个 形态上的变化由转录因子如Nanog和Rexl （锌指蛋白42, Zfg42-小 鼠的基因组信息）表达量减少和上调Fgf5和短尾突变体完成。此外 雌性胚胎的随机一条X染色体失活发生在交配后5.5天的整个外胚 层。接下来几天里，生殖细胞系的特化开
7、始于最近的最初表达Fgf5和短尾突变体的外胚层。干细胞前体特化是通过信号分子像由胚外外 胚层和内源性内胚层分泌骨形态发生蛋白（BMPs） 4和8b,随后被原始生殖细胞表达的标记基因像Stell （发育的多能性相关3, Dppa3-小鼠基因组的信息）Blimpl （调节远点包含1区段和锌指蛋白区段;Prdml-小鼠基因组信息）和Prdm14所标识。体细胞的基因像同源框A1 (Hoxal), Hoxbl, Liml (LIM 同源框蛋白 1, Lhxl-小鼠基因组信息）和Evx1 （甚至是没有同源基因1的同系物）在Stella阳性的细 胞里均被抑制，但是短尾突变体和Fgf8基因仍在这些细胞里表达,
8、 表明它们可以从外胚层的幼稚多能状态里转移并开始发育为体细胞。随后原始生殖细胞开始增殖，在妊娠中期沿着发育的后肠迁移到生殖 嵴部位，这段时间一直表达POU区段的转录因子Oct4 （Pou5f1-小鼠 基因组的信息）。虽然一直认为Oct4是多能性的标识，事实上原始生 殖细胞在体内是单能的；然而当它们在外植体或转化进畸胎瘤细胞时分离（A）受精4.5天植入期左右鼠胚获得多能性。共焦图像，免疫 染色Nanog （红色）和Gata6 （绿色）显示外胚层和内胚层各自分离。可见DAPI （蓝色） 染色的滋养外胚层（B）胚胎干细胞在抑制有丝分裂的成纤维滋养层上生长的相差显微镜下 的图像。尺寸：10“m胚胎干细
9、胞的分离最早成功从外胚层直接分离胚胎干细胞是在1981年。最初从早 期胚胎中分离多能细胞系的动机是受畸胎瘤细胞研究的启发。不仅能 自发出现在小鼠睾丸中，这些瘤细胞也可以在将卵圆筒期的胚胎移植 到成年小鼠的过程中产生。未分化的胚胎瘤细胞系在人工培养的瘤里 增殖，当注入宿主囊胚形成嵌合体时对许多组织起作用。保持多能性 的培养条件需要有抑制有丝分裂的小鼠成纤维细胞滋养层和促进所 选细胞的增殖，保持未分化状态的胎牛血清。允许囊胚（或分离的内 细胞团）在解离之前完整发育几天后分离胚胎干细胞。有关分离胚胎 干细胞的满意结果可以在更进一步培养得到的胚胎干细胞菌落确认 （见图2B）。多年以来，胚胎干细胞的来源
10、一直备受争议也很难理解。 有趣的是，分离胚胎干细胞的设备显然依赖胚胎的遗传学背景；研究 发现小鼠的129系通常可以复制，在原始培养步骤没有改变的情况下 是不可能从CBA系胚胎分离到胚胎干细胞。一些试图构建外植体在生长中的变化和胚胎干细胞成功建立的 联系的研究已经完成。例如Oct4的表达水平是一个在POU区段表达 的转录因子和多能性的标识，在从小鼠的菌株移植的胚胎产物中显著 下降，这些从129菌株移植的胚胎在Oct4水平上是耐胚胎干细胞分 离的。甚至发现在129胚胎外植体里的Oct4表达区段在一些细胞发 育的过程中是下降的，暗示胚胎干细胞的成功分离不仅依赖Oct4阳 性细胞数量的增加，也可能需要
11、遗传学和转录控制重置关键基因的表 达，这可能会创造一个仿真的，诱导培养状态。正如我们在下面讨论 的，为了细分胚胎干细胞的分离过程，理解胚胎干细胞的起源，很有 必要重新精炼一下鼠类胚胎干细胞分离培养方案。在补充白血病抑制因子的培养基的培养方案里是可以重现滋养 层细胞重要的自我更新功能，至少是在从小鼠129系胚胎分离胚胎干 细胞时有效。近期在培养基中添加Bmp4或相关生长因子来代替血清 并补充白血病抑制因子和Bmp4两种细胞因子，使有生殖细胞功能的 胚胎干细胞在限定条件下增殖。不幸的是，即使在这限定条件下，依 然不能有效地从小鼠非129系胚胎中分离有生殖功能的胚胎干细胞。 从一系列小鼠种系中分离胚
12、胎干细胞能力的显著变化与特定系在Erk 信号转导中的多样性作用相关。Erk信号通路由小鼠早期胚胎产生的 Fgf4和LIF独立激活。Erk的活动与胚胎干细胞的分化相关；抑制这 条通路则促进胚胎干细胞的自我更新。抑制Erk的活动也可以提高从 非129系小鼠胚胎分离胚胎干细胞的有效性。不能分离胚胎干细胞的种系已经被一种新方法淘汰。不是通过激 活通路阻止分化，而是用小分子来抑制特定的激酶。这个新的胚胎干 细胞培养方案被称为2i （两个抑制剂），它能够抑制Erk信号转导和 淀粉合酶激酶（Gsk3）。从本质来讲，抑制发育中胚胎Erk信号转导 促进终止分化前的活动。除非抑制Gsk3或激活Stat3信号通路，
13、否则 培养胚胎干细胞增殖的效率会很低，但是有关该过程的解救机制还没 有完全弄清楚。Gsk3抑制剂可能促进处于2i培养环境的胚胎干细胞 的翻译。，迄今检测到小鼠的种系在2i培养条件下的胚胎干细胞都可 以有效的分离出来，包括之前被认为是最难分离出胚胎干细胞的非肥 胖糖尿病小鼠。这个重要的发现证明了分离胚胎干细胞不需要特定的 遗传诱因，但是胚胎干细胞的出现可以归结为小鼠早期发育的属性。植入后胚胎产生多能细胞系源自畸胎瘤的胚胎癌细胞在雄性性腺里的自发出现增强了人们 对直接从原始生殖细胞里分离多能干细胞可能性的猜想。这由交配后 8.5天鼠胚的后面部分在含白血病抑制因子，青灰因子和Fgf4的滋养 层细胞培
14、养得出来的结论。这些统称为胚胎生殖细胞系类胚胎干细 胞。从交配后11.5-12.5天外植体的生殖嵴里也可以分离到胚胎生殖 细胞，但是处在这个发育阶段的生殖细胞必须要经历印记消除，这个 过程使胚胎生殖细胞形成嵌合体的能力减弱，尤其是形成生殖细胞 系。分离胚胎生殖细胞在移出过程有短暂的Fgf的补充，暗示着它的 增加触发了外胚层的重新编程。然而，如果原始生殖细胞直接在含白 血病抑制因子的2i培养基里培养时Fgf作用就不是必需的。好像在 这样条件下更易克服从原始生殖细胞向胚胎生殖细胞转化的障碍。这 对研究Erk和Gsk3在抑制原始生殖细胞沿通常路径分化的能力起作 用。植入后的小鼠外胚层出现了具有多能性
15、的畸胎瘤。然而还不能直 接从植入后的外胚层分离胚胎干细胞。近来用从人的囊胚分离干细胞 系的培养条件在植入后鼠胚获得了多能性细胞；尤其是移植到一个滋 养层细胞或纤连蛋白为基质激活素和Fgf2的补充培养基上。这些表 皮干细胞不能从单个细胞有效的增殖，很难促成嵌合体。它们与从人 胚胎分离的多能系的许多相同特征暗示人的胚胎干细胞可能代表一个比囊胚更晚的发育阶段（图3）。Fgf2对人的胚胎干细胞和表皮干 细胞的分离和扩展起关键作用。表皮干细胞在形成和表观遗传学上与 胚胎干细胞不同；表皮干细胞有表达Fgf5和短尾突变体的特征同时 胚胎干细胞有表达Rexl和Kif4的特点，并且没有X染色体的失活。 用像Ki
16、f4的单一的多能因子转染表皮干细胞可以使其通过重新编程 而表现胚胎干细胞的标志性特征包括有生殖细胞系的功能。在有滋养 层和白血病抑制因子的条件下长期培养也可以低水平的重新编程表 皮干细胞。这可能由于它们反转到早期外胚层阶段或通过原始生殖细 胞转化成胚胎生殖细胞。有趣的是，幼稚多能细胞能从单细胞中分离 出来，它们是与小鼠植入后外胚层隔开的细胞，然后被移植到补充有 血清和白血病抑制因子的饲养层培养基中，但这需要一个2-5周的培 养期。9 Hum-anTimE (dlays已口口 cylinderUnepeDifieJ early embryonic cellsHypcblas? PostimplBnABliari Bpiblaet* EpiSCe and human ESCsEariy epiblast and ESCbiFODhectodern图3人类胚胎分离多能细胞系（A,B
